解脂耶氏酵母親環(huán)素的原核表達(dá)與純化.pdf

1、親環(huán)素(Cyclophilins,CyPs)是一類廣泛存在于各種具細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物體內(nèi)且結(jié)構(gòu)高度保守的蛋白家族。它們是一種分子伴侶,類屬肽脯氨酰順反異構(gòu)酶超家族,能催化含脯氨酸亞氨基肽鍵異構(gòu)化,協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊、組裝和運(yùn)輸。此外,親環(huán)素還與環(huán)孢素A結(jié)合參與對機(jī)體的免疫抑制,并在細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、膽固醇代謝等生命活動中發(fā)揮的重要的作用。解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)屬于子囊菌綱真菌,它能在較廣的pH范圍內(nèi)生存,并能

2、以葡萄糖,脂肪酸和烴類等常見而廉價的物質(zhì)作為代謝底物,是一種重要的工業(yè)酵母菌。解脂耶氏酵母是非致病菌,因此能用于食品和藥物生產(chǎn)。此外,由于解脂耶氏酵母代謝分泌大量的有機(jī)酸和蛋白質(zhì)到胞外培養(yǎng)基,所以也被人們開發(fā)成為一種優(yōu)良的酵母表達(dá)系統(tǒng)。迄今發(fā)現(xiàn)并克隆的親環(huán)素家族成員已經(jīng)超過一百多種,研究者也從解脂耶氏酵母基因組中找到了13種親環(huán)素基因。
　　 本文以解脂耶氏酵母親環(huán)素基因YALI0C15653g(Gene ID:2909417)

3、為研究對象,以解脂耶氏酵母總DNA為模板,PCR擴(kuò)增該親環(huán)素基因；產(chǎn)物經(jīng)T-A克隆后進(jìn)行測序鑒定；構(gòu)建親環(huán)素原核表達(dá)載體pET32a-CyP,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS；陽性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)親環(huán)素,經(jīng)Ni-NTA金屬螯合親和層析純化親環(huán)素,純化效果通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行檢驗(yàn)?，F(xiàn)將結(jié)果小結(jié)如下:
　　 ·測序結(jié)果證實(shí)成功擴(kuò)增得到全長解脂耶氏酵母親環(huán)素基因。
　　 ·菌落PCR檢驗(yàn)證實(shí)成功構(gòu)建原核表