臍血微囊泡促進(jìn)人乳腺上皮細(xì)胞HBL-100分泌乳蛋白.pdf

1、背景：母嬰間的微囊泡（Mcrovesicles，MV）通訊機制，越來越受到人們的關(guān)注。臍血是母嬰間通訊的紐帶，在妊娠過程中，臍血微囊泡可以調(diào)節(jié)母體免疫系統(tǒng)、促進(jìn)胚胎發(fā)育和器官發(fā)育等。miRNA是一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA，是微囊泡通訊機制中重要的信息分子。微囊泡將miRNA傳遞給受體細(xì)胞，改變受體細(xì)胞的功能，從而發(fā)揮細(xì)胞間“信使”的作用。研究表明，miRNA具有調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞，促進(jìn)泌乳的作用。let-7g和miR-221可調(diào)

2、控乳腺上皮細(xì)胞的增殖及β-酪蛋白的分泌，miRNA-142-3p通過靶向調(diào)控泌乳素受體PRLR的表達(dá)，影響下游信號通路的變化，從而影響乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白的合成與分泌。本文從健康足月產(chǎn)婦新生兒臍血中分離微囊泡，通過對其結(jié)構(gòu)、與泌乳相關(guān)miRNA表達(dá)譜和生物信息學(xué)分析，以及微囊泡影響人乳腺上皮細(xì)胞HBL-100分泌酪蛋白的實驗驗證，證實存在促進(jìn)泌乳的臍血微囊泡通訊機制。有望揭示臍血微囊泡調(diào)控泌乳的現(xiàn)象及其相關(guān)機制，為母嬰間信息通訊提供新的思

3、路。
　　目的：⑴明確臍血微囊泡結(jié)構(gòu)及其miRNA特征。⑵驗證促進(jìn)泌乳的臍血微囊泡通訊方式。⑶促進(jìn)人乳腺上皮細(xì)胞分泌乳蛋白臍血微囊泡通訊機制。
　　方法：①經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)及患者本人知情同意，收集臍血標(biāo)本70例。所有患者臨床資料完整。胎盤娩出后，用臍血袋立即無菌采集新生兒臍血100 ml，6小時內(nèi)提取囊泡。②用差速離心法提取臍血微囊泡，透射顯微鏡觀察臍血微囊泡的形態(tài)，WB鑒定其表面分子CD63，激光粒度儀和納米顆

4、粒跟蹤分析儀對臍血微囊泡進(jìn)行尺度分析。RNA毛細(xì)血管電泳定性定量分析臍血微囊泡的總RNA。③通過文獻(xiàn)挖掘、數(shù)據(jù)庫搜索和同源序列分析獲得人泌乳相關(guān)miRNA，用ClueGO軟件對miRNA的靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG pathway分析，用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-靶基因的網(wǎng)絡(luò)圖。用高通量PCR分析臍血微囊泡miRNA表達(dá)譜。④用FITC標(biāo)記的微囊泡與人乳腺上皮細(xì)胞HBL-100共培養(yǎng)。共聚焦顯微鏡觀察臍血微囊泡與人乳腺上皮

5、細(xì)胞HBL-100相互作用的方式，ELISA法檢測乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中酪蛋白的含量，RT-PCR和WB檢測泌乳相關(guān)重要基因PRLR、STAT5、Akt和mTOR的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴采用12000g的離心力從健康足月產(chǎn)婦新生兒臍血中分離出平均直徑167.0±77.1nm的圓形或類圓形小體，表達(dá)膜表面抗原分子CD63。RNA毛細(xì)血管電泳顯示，在20nt處有峰值，表明臍血微囊泡內(nèi)含有miRNA。⑵通過文獻(xiàn)挖掘和數(shù)據(jù)庫

6、搜索，得到112條在小鼠、大鼠、牛、山羊、綿羊等動物泌乳期差異表達(dá)的miRNA，其中83條miRNA上調(diào)表達(dá)，29條miRNA下調(diào)表達(dá)。使用BLAST同源序列分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的miRNA中有51條miRNA與人類miRNA高度同源（E-value<6.00 E-04）,有18條下調(diào)的miRNA與人類miRNA高度同源（E-value<6.00 E-04）；使用靶基因預(yù)測工具預(yù)測miRNA的靶基因，結(jié)果顯示，上調(diào)表達(dá)的miRNA一共預(yù)測到1

7、129個靶基因，下調(diào)表達(dá)的miRNA一共預(yù)測得到835個靶基因；通過對差異表達(dá)的miRNA的靶基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)其靶基因參與的細(xì)胞生物學(xué)功能包括大分子生物合成與代謝、細(xì)胞代謝、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、RNA合成與代謝、基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等；進(jìn)一步對這些差異表達(dá)的miRNA的靶基因進(jìn)行Pathway分析。發(fā)現(xiàn)其靶基因參與的信號通路廣泛，其中包括 MAPK信號通路、腫瘤microRNA信號通路、mTOR信號通路、甲狀腺信號通路、干細(xì)胞多能性信號通

8、路、PI3K-Akt信號通路和TGF-β信號通路等；使用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果顯示， miRNA靶向調(diào)控主要由miRNA-30a， miRNA-23a， miRNA-27a， miRNA-15b， miRNA-16， miRNA-29，miRNA-22，miRNA-106a這8個miRNA參與了乳蛋白重要相關(guān)基因PRLR、STAT5、Akt和mTOR的調(diào)控。經(jīng)miRNA高通量PCR分析，共表達(dá)337個m

9、iRNA，包含let-7g、miR-221、miRNA-142-3p、miR-101a、miR-122、miR-132和 miR-27a的表達(dá)。55個泌乳相關(guān)miRNA，占臍血微囊泡總的miRNA的25.22％。選取其中26個差異表達(dá)最顯著的miRNA做qPCR驗證。平均CT值穩(wěn)定表達(dá)在20-30。⑶臍血微囊泡（30μl）與人乳腺上皮細(xì)胞HBL-100((1×105個/孔)共培養(yǎng)，隨著時間的增加培養(yǎng)液上清中酪蛋白（CSN2）的水平呈升高

10、趨勢，在共培養(yǎng)96小時，CSN2的濃度達(dá)16ng/ml，與對照組比較，有顯著差異（P<0.05）。將FITC標(biāo)記的臍血微囊泡加入到人乳腺上皮細(xì)胞HBL-100培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)4h后，觀察到HBL-100細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)綠色FITC熒光。與臍血微囊泡共培養(yǎng)48h后，觀察人乳腺上皮細(xì)胞HBL-100中PRLR、EGFR、STAT5、Akt、mTOR mRNA的表達(dá)，其中PRLR mRNA表達(dá)水平與對照組相比顯著升高（P<0.05），其余基因的mR

11、NA表達(dá)與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。Western blotting結(jié)果顯示微囊泡共培養(yǎng)組，HBL-100表達(dá)PRLR、STAT5蛋白質(zhì)水平顯著高于對照組（P<0.05）。
　　結(jié)論：①采用12000g的離心力，發(fā)現(xiàn)人臍血中存在平均直徑167.0±77.1nm的微囊泡，表達(dá)膜表面抗原CD63分子。含有大量miRNA。②臍血微囊泡包含泌乳相關(guān)miRNA，與人乳腺上皮細(xì)胞HBL-100的結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞體外分泌乳蛋