柞蠶溶繭酶活性位點的預(yù)測及驗證.pdf

1、血栓是導(dǎo)致世界各地發(fā)病率和死亡率較高的原因之一?，F(xiàn)有溶栓藥物雖然能有效溶解血栓，但易引起出血并發(fā)癥。柞蠶溶繭酶是柞蠶蛹在羽化時分泌的吐出液中的一種酶，這種酶能夠能軟化繭殼，從而使蠶蛾“脫繭而出”。本實驗室已通過實驗證明柞蠶溶繭酶具有溶栓活性，并且出血活性小，這為溶栓藥物的開發(fā)提供了一條新途徑。
　　為了研究溶繭酶結(jié)構(gòu)與溶栓活性間的關(guān)系，本論文以柞蠶溶繭酶序列為模板，通過同源建模構(gòu)建溶繭酶的三維結(jié)構(gòu)，尋找柞蠶溶繭酶的底物口袋與活性中

2、心，并通過與模式底物BAEE(Nα-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride)的分子對接，預(yù)測出可能的活性位點。同源建模及分子對接表明，44位組氨酸，87位天冬氨酸，183位絲氨酸為柞蠶溶繭酶的關(guān)鍵活性位點。
　　采用重疊延伸PCR的方法分別將天然溶繭酶氨基酸序列中的44位氨基酸CAT密碼（編碼組氨酸H44），87位氨基酸GAT密碼（編碼天冬氨酸D87）以及183位氨基酸GCG密碼（

3、編碼絲氨酸S183）定點突變?yōu)楸彼酖CG，然后構(gòu)建重組表達載體pFastBac-EGFP-GST-Cocoonase及突變表達載體pFastBac-EGFP-GST-Cocoonase-(H44A/D87A/S183A)，并利用Bac to Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)對柞蠶溶繭酶及其突變體進行表達。
　　通過SDS-PAGE及Western Blot結(jié)果顯示柞蠶溶繭酶基因及定點突變后的溶繭酶基因均獲得成功表達。將表達后的融合蛋白