溶栓酶基因的克隆及表達.pdf

1、通過纖維蛋白平板篩選、纖溶活性測定和體外溶栓分析相結(jié)合的方法，成功地從環(huán)境中篩選到一株纖溶活性較高的細菌菌株。利用細菌分類鑒定方法對其形態(tài)和生理生化特征進行了研究，發(fā)現(xiàn)其與藤黃微球菌的特征相符。根據(jù)細菌16SrDNA的保守序列設(shè)計1對引物，采用PCR技術(shù)擴增出該菌的16SrDNA片段，對該序列克隆后測序，并與已報道的序列進行比對?！　榱诉M一步探討溶栓酶基因的異源表達特性，根據(jù)豆豉溶栓酶基因前肽-成熟肽的N-端和C-端編碼序列分別設(shè)計

2、2對引物，并在引物N-端和C-端分別引入EcoRⅠ和BamHⅠ識別序列，分別以解淀粉芽孢桿菌及藤黃微球菌基因組DNA為模板，擴增出豆豉溶栓酶的前肽-成熟肽序列(1059bp)和MLFE成熟肽編碼區(qū)(828bp)。擴增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體中，所獲重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，將其克隆到大腸桿菌高效表達質(zhì)粒pMAL-p2X中，構(gòu)建溶栓酶基因-麥芽糖結(jié)合蛋白基因相融合的表達質(zhì)粒pMAL-pDFE及pMAL-MLFE。

3、 為了實現(xiàn)豆豉溶栓酶類的異源高效表達，利用PCR技術(shù)從解淀粉芽孢桿菌DC-4總DNA中擴增出α-淀粉酶全基因，在此基礎(chǔ)上進一步克隆其啟動子-信號肽編碼序列。 對豆豉溶栓酶工程菌株WB-DFE5(WB600/pSU-AmyDFE)進行了搖瓶條件下的發(fā)酵研究，確定了發(fā)酵的優(yōu)化條件。 為了進一步提高溶栓酶的表達水平，從枯草桿菌WB600中克隆了果聚糖蔗糖酶基因的啟動子-信號肽編碼序列(sacR)并與proDFE形成融合基因(