脂類(lèi)小分子ETI對(duì)γ-分泌酶活性調(diào)控作用的研究及該酶新底物AXL剪切位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn).pdf

1、研究目的：
　　（1）研究生物活性脂類(lèi)及其類(lèi)似物對(duì)γ-分泌酶的活性調(diào)控作用，以期篩選出抑制效果較好的γ-分泌酶抑制劑（γ-secretase inhibitor，GSI），并初步探討其作用機(jī)制，為阿爾茨海默癥（Alzheime's disease，AD）的新型藥物治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；
　?。?）通過(guò)研究γ-分泌酶對(duì)新底物AXL的剪切作用，確定其對(duì)AXL的剪切位點(diǎn)，為γ-分泌酶的剪切機(jī)制以及確定AXL剪切產(chǎn)物提供理論基礎(chǔ)；

2、>　　研究方法：
　?。?）體外表達(dá)并純化γ-分泌酶的底物C100（APP截短形式）、N100（Notch的截短形式）；表達(dá)γ-分泌酶的四個(gè)亞基，并提取γ-分泌酶純酶；
　?。?）建立γ-分泌酶體外酶切模型，通過(guò)剪切產(chǎn)物AICD/NICD的積累量來(lái)判斷γ-分泌酶的活力；
　?。?）測(cè)試脂類(lèi)物質(zhì)ETI對(duì)γ-分泌酶的調(diào)節(jié)作用，Western blot檢測(cè)剪切產(chǎn)物AICD/NICD的表達(dá)量；Wiltfang blot檢測(cè)Aβ

3、40、Aβ42的表達(dá)量；
　　（4）采用磷脂競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)及分子模擬初步闡述ETI對(duì)γ-分泌酶的作用機(jī)制；
　?。?）設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR，將野生型AXL跨膜區(qū)中相應(yīng)位置的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，經(jīng)過(guò)抗性篩選出單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后進(jìn)行DNA測(cè)序，確定突變成功；
　?。?）將突變后的AXL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，加入γ-分泌酶抑制劑處理過(guò)夜，裂解細(xì)胞，用Western blot檢測(cè)底物CTF的積累情況，間接判斷γ-

4、分泌酶對(duì)AXL的剪切作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　?。?）以pET-21b為載體，成功提取了γ-分泌酶相關(guān)底物N100、C100；培養(yǎng)穩(wěn)轉(zhuǎn)了γ-分泌酶PS1、PEN2-Flag、Aph1-HA、NCT-V5/His四個(gè)亞基的S20細(xì)胞，并提取了γ-分泌酶；
　?。?）通過(guò)體外酶活測(cè)試發(fā)現(xiàn)了一種長(zhǎng)鏈脂肪酸類(lèi)似物二十碳三炔酸（5，8，11-Eicosatriynoic acid，ETI）對(duì)γ-分泌酶具有抑制作用，并在細(xì)胞水平驗(yàn)

5、證其對(duì)γ-分泌酶同樣具有抑制效果；
　?。?）探討了以底物N100、C100為研究對(duì)象時(shí)ETI對(duì)γ-分泌酶的作用效果。發(fā)現(xiàn)以C100為底物時(shí)，ETI對(duì)γ-分泌酶的抑制效果明顯，而以N100為底物時(shí)，ETI對(duì)γ-分泌酶的活性沒(méi)有影響；
　?。?）磷脂競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明高濃度的磷脂分子能夠減弱或抵消ETI對(duì)γ-分泌酶的抑制作用，而低濃度的磷脂分子不能影響ETI對(duì)γ-分泌酶的抑制作用；通過(guò)分子模擬，預(yù)測(cè)了ETI與γ-分泌酶相互作用機(jī)制，

6、發(fā)現(xiàn)ETI與γ-分泌酶亞基存在結(jié)合位點(diǎn)；
　?。?）AXL跨膜區(qū)單個(gè)氨基酸突變或缺失后γ-分泌酶對(duì)底物AXL依然發(fā)揮剪切作用；AXL跨膜區(qū)靠近胞內(nèi)的6個(gè)氨基酸突變后γ-分泌酶對(duì)底物AXL依然發(fā)揮剪切作用；當(dāng)靠近胞外的前8個(gè)氨基酸和靠近胞內(nèi)的后6個(gè)氨基酸均突變后，γ-分泌酶對(duì)底物AXL不能發(fā)揮剪切作用；而僅對(duì)AXL跨膜區(qū)靠近胞外的前8個(gè)氨基酸突變，γ-分泌酶對(duì)底物AXL仍不能發(fā)揮剪切作用；
　?。?）僅突變跨膜區(qū)上述前8個(gè)氨基

7、酸中的前4個(gè)或者后4個(gè)氨基酸后，γ-分泌酶依然能夠?qū)Φ孜顰XL進(jìn)行剪切。
　　結(jié)論：
　?。?）一種含有20個(gè)碳原子及3個(gè)碳碳三鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸類(lèi)似物二十碳三炔酸（5，8，11-Eicosatriynoic acid，ETI）對(duì)γ-分泌酶有選擇性抑制作用，并能同時(shí)抑制γ-分泌酶剪切產(chǎn)物Aβ40、Aβ42的產(chǎn)生。ETI可能通過(guò)置換γ-分泌酶復(fù)合物中的兩個(gè)磷脂分子而抑制其酶活力；
　　（2）γ-分泌酶能夠識(shí)別并剪切底物AXL