Bacillus aerius S-7菌株纖溶酶的分離純化及溶纖活性分析.pdf

1、血栓性疾病是一類嚴(yán)重危害人類尤其是中老年人身體健康和生命的疾病,常見的有急性心肌梗死、腦血栓、肺靜脈栓塞、動(dòng)脈血栓和缺血性休克等,其中急性心肌梗死的病死率高達(dá)30％。近年來,溶栓藥物的研發(fā)主要集中在兩方面,一方面為篩選新來源的溶栓藥物,另一方面為通過基因工程和單克隆抗體技術(shù)改造已有溶栓藥物,其目的是降低纖溶酶的抗原性,提高其安全性及活力。多數(shù)有效的溶栓劑是從生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的,生物體是溶栓藥物的主要來源,由于微生物來源的纖溶酶具有很多優(yōu)點(diǎn),

2、所以其是纖溶酶的重要來源之一,已有多種纖溶酶產(chǎn)生菌被分離出來,因而得到各國研究者的重視。
　　 本文利用纖維蛋白平板法從豆豉中篩選到一株纖溶酶高產(chǎn)菌株,命名為S-7,進(jìn)行菌株鑒定并優(yōu)化其最佳液體發(fā)酵條件,分離純化S-7菌株產(chǎn)生的纖溶酶,研究其酶學(xué)性質(zhì)及體外溶栓特性,并對其動(dòng)物安全性進(jìn)行了研究。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 根據(jù)菌落、菌體形態(tài)觀察、生理生化反應(yīng)及16SrDNA序列分析表明,纖溶酶產(chǎn)生菌S-7與芽孢桿菌屬(Bac

3、illusspp.)的Bacillusaerius形態(tài)相似、生理生化特征基本相符,再結(jié)合16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹同源性分析,兩者同源性達(dá)到99.60%,因此,初步確定纖溶酶產(chǎn)生菌S-7為Bacillusaerius。
　　 采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對BacillusaeriusS-7進(jìn)行產(chǎn)纖溶酶搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化,結(jié)果表明最佳培養(yǎng)基組成為:玉米粉5g,葡萄糖5g,豆餅粉20g,K2HPO4·12H2O2g,KH2PO4·2H2

4、O1g,MgSO4·7H2O1.5g,CaCl2·2H2O0.5g,NaCl1g,蒸餾水1000mL,培養(yǎng)基初始pH值7.5,最佳發(fā)酵條件為:250mL三角瓶裝液量30mL,接種量2%,培養(yǎng)溫度37℃、旋轉(zhuǎn)搖床轉(zhuǎn)數(shù)200r/min,發(fā)酵時(shí)間48h,在此條件下該菌產(chǎn)纖溶酶酶活力(相當(dāng)于尿激酶)達(dá)到942.09±4.18U/mL,,比未優(yōu)化前提高4.7倍。
　　 通過硫酸銨沉淀、透析以及DEAE-Sepharose陰離子交換層析的方

5、法提取純化BacillusaeriusS-7產(chǎn)生的纖溶酶,結(jié)果獲得單一纖溶酶組分(S-7FE-1),表觀相對分子質(zhì)量為55kDa,測得S-7FE-1N-末端10個(gè)氨基酸為ANLNGTLGGM,N-末端氨基酸序列分析表明S-7FE-1與己報(bào)道的其它生物來源的纖溶酶沒有同源性,屬于新型纖溶酶。S-7FE-1的最適作用溫度為30℃,最適反應(yīng)pH為8.0,在pH4到9以及4℃到50℃之間活性穩(wěn)定,Fe3+使S-7FE-1完全失活,而其他離子對其