人胃癌耐藥細(xì)胞株的建立和新型β-內(nèi)酰胺類化合物抗腫瘤耐藥研究.pdf

1、第一部分：人胃癌耐紫杉醇細(xì)胞株MGC803/PTX的建立及機(jī)制研究
　　采用紫杉醇濃度梯度遞增法誘導(dǎo)人胃癌 MGC803細(xì)胞建立耐藥細(xì)胞株MGC803/PTX，探討人胃癌耐藥細(xì)胞MGC803/PTX與親本細(xì)胞MGC803之間的差異。
　　方法：用紫杉醇以濃度梯度遞增誘導(dǎo)法構(gòu)建人胃癌耐藥細(xì)胞株 MGC803/PTX；倒置顯微鏡下觀察紫杉醇誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；CCK8法檢測MGC803/PTX細(xì)胞株的耐藥指數(shù)及其穩(wěn)定性；C

2、CK8法檢測MGC803/PTX細(xì)胞株對5-FU和ADR的耐藥性；細(xì)胞計數(shù)法繪制MGC803和MGC803/PTX細(xì)胞株的生長曲線；克隆形成實(shí)驗(yàn)測定MGC803和MGC803/PTX細(xì)胞株的克隆形成率；熒光顯微鏡下觀察紫杉醇作用后細(xì)胞和細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡和周期分布情況。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測耐藥細(xì)胞株與親本細(xì)胞株中P-gp、Bcl-2、Bax、PARP、β-catenin、p-GSK-3β等蛋白的表達(dá)，比

3、較兩株細(xì)胞蛋白表達(dá)的差異，分析MGC803/PTX細(xì)胞株可能的耐藥機(jī)制。
　　結(jié)果：歷時10個月成功構(gòu)建了人胃癌耐藥細(xì)胞株MGC803/PTX，對紫杉醇的耐藥指數(shù)為9.3，誘導(dǎo)過程中細(xì)胞由長梭形逐步變成短多邊形，體積變小，誘導(dǎo)結(jié)束后3個月內(nèi)紫杉醇對MGC803/PTX細(xì)胞IC50變化不大。MGC803/PTX對5-FU和ADR這兩種化療藥物存在一定的交叉耐藥性，RI分別為4.38和1.4；耐藥細(xì)胞MGC803/PTX的生長速度比親

4、本細(xì)胞MGC803慢，群體倍增時間延長，分別為24.55h和22.5h；MGC803和MGC803/PTX細(xì)胞克隆形成率有明顯差異（p<0.001），耐藥細(xì)胞MGC803/PTX克隆形成能力明顯高于親本細(xì)胞MGC803；PTX作用兩株細(xì)胞，Hoechst33258染色后細(xì)胞核的染色增強(qiáng)，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮且有凋亡小體生成，但MGC803/PTX細(xì)胞凋亡率明顯低于MGC803細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果同樣顯示耐藥細(xì)胞株 MGC803/PTX凋

5、亡率低于 MGC803細(xì)胞，20nMPTX作用后凋亡率分別為1.8％和24.2%。MGC803/PTX細(xì)胞周期分布中 G0/G1期占71.95%、S期占14.8%、G2期占10.15%，親本細(xì)胞 MGC803中G1期占62.4%、S期占11.275%、G2期占20.47%，耐藥株中G0/G1期明顯增多。耐藥細(xì)胞株MGC803/PTX與親本細(xì)胞相比，P-gp、Bcl-2、PARP蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax、β-catenin和p-GSK-3β蛋

6、白的表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1首次成功建立了穩(wěn)定的人胃癌耐藥細(xì)胞株MGC803/PTX；
　　2耐藥細(xì)胞株MGC803/PTX的生物學(xué)特性包括細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞增殖率，細(xì)胞凋亡率，周期分布等均發(fā)生明顯變化；
　　3與親本細(xì)胞MGC803比較，P-gp明顯上調(diào)，抗凋亡蛋白Bax明顯下調(diào)，同時促凋亡蛋白 Bcl-2，PARP等也有一定程度的上調(diào)，這是其耐藥的部分原因。同時耐藥細(xì)胞MGC803/PTX中，β-caten

7、in和p-GSK-3β蛋白的表達(dá)與MGC803細(xì)胞比較也有差異，說明其耐藥機(jī)制與Wnt/β-catenin相關(guān)通路有關(guān)。
　　第二部分：化合物20對MGC803/PTX的作用研究
　　探討新型化合物20對耐藥細(xì)胞株MGC803/PTX的作用，以及初步的機(jī)制研究。
　　方法：CCK8法檢測不同作用時間化合物20對MGC803/PTX的抗腫瘤活性；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測化合物20對單個細(xì)胞增殖的作用；Hoechst33258染色

8、法觀察化合物20作用后MGC803/PTX細(xì)胞核形態(tài)變化；高內(nèi)涵分析技術(shù)結(jié)合PI染色法檢測化合物20對耐藥細(xì)胞周期阻滯作用；Western blot檢測化合物20作用后P-gp、Bcl-2、Bax、Pro-PARP1、Cleaved caspase-3等蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物20對MGC803和MGC803/PTX細(xì)胞均有很好的活性；化合物20作用后MGC803/PTX細(xì)胞出現(xiàn)明顯的染色質(zhì)皺縮，核碎

9、裂等細(xì)胞凋亡形態(tài)；化合物20作用后MGC803/PTX細(xì)胞周期分布發(fā)生變化，G2/M期占的比例明顯增多；化合物20作用后P-gp、Bcl-2、Pro-PARP1蛋白下調(diào)，Bax，Cleaved caspase-3上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1化合物20對MGC803/PTX細(xì)胞有很強(qiáng)的增殖抑制作用
　　2化合物20能將MGC803/PTX細(xì)胞阻滯在G2/M期
　　3化合物20的作用機(jī)制與細(xì)胞線粒體凋亡通路有關(guān)，能上調(diào)