靶向微管雙吲哚類化合物的篩選及HD-ZWM-288抗腫瘤多藥耐藥的研究.pdf

1、近年來，全球新發(fā)癌癥病例及死亡人數(shù)逐年上升。由于微管在有絲分裂事件中的作用，其已經(jīng)是醫(yī)學(xué)上經(jīng)過驗(yàn)證的化療藥物的靶點(diǎn)。我們首先對(duì)基于微管靶點(diǎn)的化合物進(jìn)行篩選，所采用的雙吲哚類化合物是在從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)的具有良好抗癌生物活性的新吲哚咔巴唑生物堿的基礎(chǔ)上，對(duì)已有的雙吲哚類化合物進(jìn)行修飾和改造得到的。
　　在前期工作的基礎(chǔ)上，我們最終選用這十五個(gè)化合物進(jìn)行微管作用的篩選。我們對(duì)首先分析實(shí)驗(yàn)中的十五個(gè)化合物對(duì)細(xì)胞周期的作用。結(jié)果顯示，大部

2、分所選用的雙吲哚類化合物都有不同程度的周期阻滯作用。其中，在具有G2/M期阻滯作用的化合物中，HD-ZWM-288,HD-ZWM-597的作用最強(qiáng)。因此，我們推測HD-ZWM-288,HD-ZWM-597可能具有靶向微管的抗腫瘤活性。但由于HD-ZWM-597在體外實(shí)驗(yàn)中毒性較大，HD-ZWM-288作為候選先導(dǎo)物進(jìn)行深入的體內(nèi)外靶向微管的抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究。對(duì)HD-ZWM-288進(jìn)行計(jì)算機(jī)擬合分析，結(jié)果顯示HD-ZWM-288與

3、靶點(diǎn)有非常好的對(duì)接。鑒于以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測HD-ZWM-288具有較好的靶向微管藥物的潛力，后續(xù)的試驗(yàn)及機(jī)制的研究由李琳師姐完成，并且后續(xù)的研究表明，HD-ZWM-288確實(shí)具有良好的靶向微管的抗腫瘤的作用。
　　但是，大多數(shù)微管抑制劑的副作用較大，并且使用過程中較易出現(xiàn)耐藥性。因此，急需開發(fā)活性更強(qiáng)、副作用較小，并且對(duì)多藥耐藥細(xì)胞也有效的新型微管抑制劑。在對(duì)化合物HD-ZWM-288的抗腫瘤的機(jī)制研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)其具有

4、較好的抗多藥耐藥的作用。
　　MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于阿霉素和長春新堿，HD-ZWM-288對(duì)MDR細(xì)胞表現(xiàn)出有效的細(xì)胞毒性，尤其對(duì)K562/A02及K562這一組細(xì)胞作用最明顯。而對(duì)正常細(xì)胞具有較小的細(xì)胞毒性。不同濃度HD-ZWM-288作用的K562/A02及K562細(xì)胞12h，在顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞裂解成碎片等形態(tài)變化。AnnexinⅤ/PI雙染法以及Western blot結(jié)果表明，HD-ZWM-288可以

5、誘導(dǎo)K562/A02及K562細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。
　　MDR的產(chǎn)生機(jī)制中最常見的是ATP結(jié)合膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族過量表達(dá)誘發(fā)細(xì)胞外排作用增強(qiáng)。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果說明，在HD-ZWM-288可以誘導(dǎo)K562/A02及K562細(xì)胞內(nèi)的羅丹明的積累量呈濃度依賴性增加。Western Blot及實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)說明HD-ZWM-288可以抑制P-gp的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平?；谶@些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，HD-ZWM-288是通過有效地抑制P-gp的作用，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)

6、藥物的積累量，誘導(dǎo)耐藥腫瘤細(xì)胞細(xì)胞凋亡。
　　影響P-gp表達(dá)的信號(hào)通路主要有ROS、MAPK、PI3K/AKT、及NF-κB信號(hào)通路。在本研究中，HD-ZWM-288可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平升高，線粒體膜電位下降，以及細(xì)胞色素C的釋放。這些試驗(yàn)結(jié)果說明，HD-ZWM-288可能是通過ROS的產(chǎn)生來影響B(tài)cl-2和Bax的表達(dá)，從而引起細(xì)胞凋亡。作為ROS的下游信號(hào)，MAPK與腫瘤的耐藥性息息相關(guān)。在本研究中，HD-ZWM-28

7、8可以顯著降低ERK/MAPK通路的表達(dá)水平，增加P38/MAPK通路的表達(dá)水平，增加了JNK/SAPK通路的表達(dá)水平。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測HD-ZWM-288的抑制耐藥細(xì)胞生長活性與其調(diào)節(jié)的這些蛋白激酶有關(guān)。
　　MDR1啟動(dòng)子區(qū)域存在著NF-κB的結(jié)合序列，NF-κB能夠激活連接MDR1啟動(dòng)子的基因轉(zhuǎn)錄。AKT是NF-κB的上游信號(hào)，可以調(diào)控NF-κB的表達(dá)。在本研究中，HD-ZWM-288可以顯著抑制AKT的磷酸化，增

8、加IκBα的表達(dá)，進(jìn)而降氐NF-κB的磷酸化。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AKT/NF-κB信號(hào)通路也參與了HD-ZWM-288引起的P-gp的表達(dá)降低。
　　在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)HD-ZWM-288在細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡之前可以引起明顯的G2/M期阻滯。為了驗(yàn)證ROS是否參與HD-ZWM-288引起的細(xì)胞周期阻滯，我們用ROS清除劑NAC提前處理細(xì)胞。結(jié)果顯示，在NAC的作用下，可以逆轉(zhuǎn)HD-ZWM-288引起的G2/M期阻滯。以上這些實(shí)驗(yàn)結(jié)

9、果說明，ROS是也參與HD-ZWM-288引起的細(xì)胞周期阻滯。
　　綜上所述，HD-ZWM-288具有較好的抗腫瘤多藥耐藥作用。在HD-ZWM-288的作用下，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，一方面降低Bcl-2的表達(dá)，激活Bax蛋白家族，從而使線粒體膜電位下降，線粒體膜破裂，細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。另一方面通過作用于MAPK和AKT/NF-κB信號(hào)通路，抑制P-gp的表達(dá)，進(jìn)而增加細(xì)胞內(nèi)藥物積累量，引起細(xì)胞凋亡。同時(shí)HD-ZWM