不同來源細菌中floR基因的流行分布及其傳播機制的研究.pdf

1、目的：
　　本文主要通過研究浙江溫州地區(qū)不同動物源（包括魚、牛、兔、雞、鴨、鵝）和周圍環(huán)境（包括土壤、池水、養(yǎng)殖場排出的污水）來源的細菌對氟苯尼考的耐藥性，了解氟苯尼考抗性基因floR在不同來源細菌中的分布情況，探討floR基因相關(guān)可移動DNA元件的結(jié)構(gòu)及其水平傳播機制，為耐藥性的形成和傳播提供有效防治依據(jù)，為獸醫(yī)治療和新藥開發(fā)提供參考。
　　方法：
　　1.從浙江溫州地區(qū)不同養(yǎng)殖場采集牛、兔、雞、鴨、鵝的新鮮糞便樣本

2、，魚腸道樣本及周圍環(huán)境中土壤、池水、養(yǎng)殖場排出的污水樣本，將不同來源的樣本稀釋后分別在LB固體培養(yǎng)基上進行涂布培養(yǎng)，挑取單個菌落對細菌進行分離純化；
　　2.對分離純化好的細菌做生化鑒定，提取細菌基因組進行16s rRNA基因測序鑒定，確定細菌種屬；
　　3.采用瓊脂稀釋法對不同來源細菌進行氟苯尼考、氯霉素、四環(huán)素、頭孢噻呋鈉、恩諾沙星5種抗生素的藥物敏感性試驗，分析不同來源細菌的耐藥情況；
　　4.以細菌基因組為模板

3、，通過PCR擴增篩查細菌中floR陽性菌株，PCR產(chǎn)物通過測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫比對確定floR基因陽性菌株，了解不同來源細菌中floR基因的分布情況；
　　5.選取牛、雞、鵝來源的floR陽性大腸埃希菌進行脈沖場電泳，分析floR陽性大腸埃希菌株間的同源性，了解本地區(qū)克隆傳播現(xiàn)象；
　　6.根據(jù)藥敏結(jié)果，選取43株 floR基因陽性、對氟苯尼考高度耐藥（MIC≥512μg/ml）且含有質(zhì)粒的菌株進行接合轉(zhuǎn)移試驗，并對接合子

4、進行鑒定，提取質(zhì)粒，用PCR驗證質(zhì)粒是否攜帶floR基因，同時用瓊脂稀釋法檢測接合子對氟苯尼考和氯霉素的藥物敏感性，分析floR基因的水平轉(zhuǎn)移能力；
　　7.挑取一株鵝來源的大腸埃希菌和土壤來源的大腸埃希菌，分別提取基因組進行全基因組測序，定位floR基因，分析其側(cè)翼區(qū)域及相關(guān)可移動元件。
　　結(jié)果：
　　1.本次實驗從溫州地區(qū)不同養(yǎng)殖場及周圍環(huán)境中共分離培養(yǎng)得到337株細菌，其中魚來源細菌53株，兔來源細菌62株，牛

5、來源細菌46株，雞來源細菌41株，鴨來源細菌28株，鵝來源細菌38株，土壤來源細菌27株，池水來源細菌20株，污水來源細菌23株。
　　2.經(jīng)過生化鑒定和16s rRNA基因測序鑒定，337株不同來源細菌中，以腸桿菌科細菌為主，有296株，占細菌總數(shù)的87.83％，其中以埃希菌屬中的大腸埃希菌最多見，有186株，占腸桿菌科細菌的62.84%，占總細菌數(shù)的55.19%。
　　3.不同來源的細菌對各種抗生素的耐藥情況不同，296

6、株腸桿菌科細菌對氯霉素耐藥的菌株有136株，耐藥率為45.95%，氟苯尼考低敏感（MICs≥32μg/ml）菌株有139株，占46.96%。
　　4.在296株腸桿菌科細菌中，有126株攜帶floR基因，陽性率為45.57%。floR基因陽性菌株都對氟苯尼考表現(xiàn)出一定程度的耐藥性。
　　5.對牛、雞和鵝來源的42株floR基因陽性大腸埃希菌進行脈沖場凝膠電泳，大部分條帶分子量在20～700 kb，條帶數(shù)目在5～28條左右，可

7、以分為39個PFGE型，有三對菌株相似度比較高。
　　6.對43株攜帶質(zhì)粒的floR基因陽性菌株進行肉湯法接合轉(zhuǎn)移試驗，成功獲得 floR基因陽性接合子8株。
　　7.全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)鵝來源的大腸埃希菌攜帶的floR基因結(jié)構(gòu)與本實驗室已經(jīng)測序的肺炎克雷伯菌 FK1341的結(jié)構(gòu)相似，上、下游都有 TnpA轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，而土壤來源的大腸埃希菌則略有不同。
　　結(jié)論：
　　1.在不同樣本分離得到的細菌中，以腸桿菌科細

8、菌為主，占細菌總數(shù)的87.83%，是各種樣本中普遍存在的細菌，通過對其耐藥性分析可以反映農(nóng)場中細菌耐藥性發(fā)生情況。
　　2.不同來源的細菌對各種抗生素的耐藥情況不同，其中鵝來源的耐藥率最高，可能與抗生素使用頻率有關(guān)。并且在水和土壤中也檢出了氟苯尼考低敏感性菌株，可能是由于近些年氟苯尼考在畜禽養(yǎng)殖業(yè)廣泛應(yīng)用使其在環(huán)境中不斷的積累造成。
　　3. floR基因是最常見的氟苯尼考抗性基因，在氟苯尼考低敏感性的139株細菌中，有12

9、6株攜帶floR基因，13株未檢測到floR基因，可能含有其他氟苯尼考抗性基因。
　　4.大腸埃希菌之間存在相似度高的菌株，表明floR陽性大腸埃希菌在本地的動物之間可能發(fā)生了克隆傳播的現(xiàn)象。
　　5.接合轉(zhuǎn)移試驗成功說明floR基因可以隨著其所在質(zhì)粒在不同種屬細菌之間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。另外，本研究中測序分析的大腸埃希菌floR基因側(cè)翼區(qū)域具有轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)和其他耐藥基因，基因環(huán)境結(jié)構(gòu)復(fù)雜，floR基因可能通過可移動DNA元件發(fā)生轉(zhuǎn)