大鼠急性心肌缺血后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)變化及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　 在法醫(yī)實(shí)際鑒定工作中,對(duì)缺血缺氧性心肌病變引起的心源性猝死的法醫(yī)學(xué)鑒定一直是困擾法醫(yī)和病理學(xué)界的難題。心肌缺血缺氧性損傷后,往往可致個(gè)體在短時(shí)內(nèi)死亡。此類心肌缺血所致心源性猝死案例,發(fā)病急驟,死亡迅速,通常缺乏明顯的冠狀動(dòng)脈病變及典型的心肌病理形態(tài)學(xué)所見。而典型病理形態(tài)學(xué)改變的出現(xiàn)往往在心肌供血完全中斷6小時(shí)后,才可能通過HE染色觀察到。對(duì)于無明顯冠狀動(dòng)脈及心肌病變的案例,主要是用排除其他死因(如機(jī)械性窒息、急性中

2、毒等)的方法來診斷。體內(nèi)的某些免疫組織化學(xué)和生化學(xué)指標(biāo)可在心肌缺血缺氧性損害發(fā)生后,數(shù)分鐘內(nèi)迅速表達(dá)升高,對(duì)心肌缺血所致的心源性猝死的法醫(yī)學(xué)診斷有重要意義。本研究主要由兩部分構(gòu)成:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及法醫(yī)學(xué)解剖例檢驗(yàn)。第一部分,建立大鼠急性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?觀察大鼠缺血期心肌VEGF免疫組織化學(xué)染色特點(diǎn)及其表達(dá)隨時(shí)間的變化規(guī)律,同時(shí)監(jiān)測(cè)其心電圖改變。第二部分,選取2種免疫組織化學(xué)指標(biāo)VEGF、Mb和2種生化學(xué)指標(biāo)CK-MB、cTnT,通過38例法

3、醫(yī)學(xué)實(shí)際鑒定案例,對(duì)比研究VEGF及Mb在缺血性心臟病解剖例心肌中的表達(dá)情況,綜合分析缺血性心臟病死者心包液中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)濃度變化規(guī)律,探討上述因子在心肌缺血的法醫(yī)學(xué)鑒定中的應(yīng)用價(jià)值。
　　 實(shí)驗(yàn)材料和方法：
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn):健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重280～300g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將其隨機(jī)分為6組,每組9只,其中5組為實(shí)驗(yàn)組,1組為正常對(duì)照

4、組。通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支,建立大鼠急性心肌缺血模型,通過powerlab監(jiān)測(cè)記錄標(biāo)準(zhǔn)第Ⅱ?qū)?lián)大鼠心電改變。分別于手術(shù)結(jié)扎LAD后15min、30min、1h、3h和6h將大鼠頸椎脫位。處死后,取出大鼠心臟。去除結(jié)扎線以上心肌,于結(jié)扎線下5mm處,將大鼠心臟橫斷為兩部分,取上半部分心肌,放入4％多聚甲醛固定、制作蠟塊,用于HE染色及VEGF免疫組織化學(xué)染色。取下半部分心尖部心肌組織,提取蛋白,用于western-blot檢測(cè)。

5、　　 解剖例檢驗(yàn):收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理教研室2008年3月-2010年3月的實(shí)際解剖案例,共計(jì)38例,其中心肌缺血15例,心肌梗死13例,高墜及交通肇事所引起的多器官損傷10例。參照缺血心臟病分類有關(guān)文獻(xiàn),將缺血性心臟病分為以下兩組:1.心肌缺血組,大體解剖發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈不同程度管腔狹窄,組織學(xué)檢查可見局部心肌纖維嗜伊紅染色增強(qiáng),但未檢見心肌凝固性壞死、心肌間質(zhì)出血等所見;2.心肌梗死組,組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)左室前壁有心肌凝固性壞

6、死、心肌問質(zhì)出血。取左冠狀動(dòng)脈前降支支配區(qū)心肌組織,制作蠟塊,用于HE染色和VEGF、Mb免疫組織化學(xué)染色;取上述案例心包液,采用化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法(Chemiluminescence immumo-assay,CLIA)測(cè)定cTnT、CK-MB濃度。
　　 結(jié)果：
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:心電監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,正常對(duì)照組大鼠心電未發(fā)生改變,實(shí)驗(yàn)組大鼠心電圖均顯示ST段抬高。另有9只大鼠發(fā)生致死性心律失常。正常對(duì)照組大鼠心肌未見

7、VEGF表達(dá);缺血15min組,缺血區(qū)心內(nèi)膜下可見VEGF弱陽性表達(dá),隨著缺血時(shí)間的逐漸增加,VEGF的表達(dá)逐漸增強(qiáng)。缺血3h組,VEGF廣泛表達(dá)于缺血區(qū)、缺血周邊區(qū)等心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。缺血6h組,VEGF表達(dá)強(qiáng)度較結(jié)扎3h組有所下降。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間段VEGF變化強(qiáng)度呈規(guī)律性變化。對(duì)照組,VEGF幾乎不表達(dá);從缺血15min開始,VEGF蛋白開始表達(dá),缺血3h組VEGF表達(dá)達(dá)到高峰,缺血6h組較缺血3h組強(qiáng)度有所下降,但仍處于較高水

8、平。
　　 解剖例檢驗(yàn)部分:15例心肌缺血案例及13例心肌梗死案例均在心肌細(xì)胞中檢出VEGF陽性著色,VEGF的表達(dá)部位多位于缺血區(qū)或梗死灶周邊區(qū),梗死區(qū)偶見VEGF陽性顆粒。對(duì)照組案例未見陽性反應(yīng)。15例心肌缺血案例及13例心肌梗死案例除在正常心肌細(xì)胞中均檢出Mb陽性著色外,缺血區(qū)及梗死灶周邊區(qū)心肌間質(zhì)中檢出Mb陽性著色。對(duì)照組案例除在心肌細(xì)胞中檢見Mb陽性著色外,心肌間質(zhì)中未見棕黃色的陽性反應(yīng)。心肌缺血及心肌梗死組心包液中C

9、K-MB、cTnT濃度高于對(duì)照組,且VEGF、Mb陽性面積與心包液中CK-MB濃度成正比。相關(guān)分析結(jié)果顯示,心肌梗死和心肌缺血組VEGF、Mb和CK-MB彼此之間存在相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1.VEGF對(duì)心肌缺血反應(yīng)敏感,在心肌缺血15分鐘后,即可觀察到心肌缺血組VEGF開始表達(dá),隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng),VEGF表達(dá)增加,于心肌缺血3小時(shí)達(dá)到高峰;
　　 2.心肌中VEGF、Mb的分布及心包液中CK-MB濃度呈