納米粒子介導血管內皮生長因子基因治療兔心肌缺血的療效.pdf

1、實驗背景:應用血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)基因轉染治療缺血性心臟病，在國內外已研究多年，并取得初步有效的臨床試驗結果。在相關的大多數(shù)臨床試驗中采用的基因載體是裸質?；虿《据d體，裸質粒介導基因轉染效率低，易被體內核酸酶降解，外源基因表達時效短；病毒載體如腺病毒轉染效率高，但存在著免疫反應的危險。因此繼續(xù)尋求安全、有效的基因傳遞系統(tǒng)是其研究領域的一個重要方面。 近年來，

2、納米級聚合物粒子開始用于基因的傳遞，實驗已證實納米粒子包裹寡聚核苷酸后，可增加寡核苷酸進入細胞內的量；同時增加寡核苷酸對抗核酸酶的能力，防止寡核苷酸的降解，增強其在細胞內的穩(wěn)定性。同時納米粒子因其良好的組織穿透能力，極易被細胞吸收以及所具有的控釋效應，使之在血管疾病的治療中有著潛在的不可比擬的優(yōu)越性。 目的: 1.制備VEGF基因納米粒子并觀察其一般性狀。 2.VEGF基因納米粒子體外轉染心肌細胞的實驗研究。3.

3、心肌細胞吞噬VEGF基因納米粒子的形態(tài)學研究。 4.VEGF基因納米粒子對心肌缺血的療效觀察。 方法1.制備VEGF基因納米粒子向聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)二氯甲烷溶液中加入濃度為10mg/ml的pcDNA3.1/VEGF165質粒1ml，高速攪拌至油包水乳液；再加入1.0％聚乙烯醇(PVA)水溶液繼續(xù)攪拌成水/油/水復乳液；旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸去二氯甲烷；4℃，10000r/min離心10min，加蒸餾水離心清洗3次

4、；取上清液進行DNA包封率的計算，收集沉淀冷凍干燥，備用。測定其載藥量、體外釋放情況及粒徑。 2.VEGF基因納米粒子轉染心肌細胞培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，傳代后按2×105個細胞/孔，接種于24孔板中，培養(yǎng)48h，使達到80％融合。于6個孔中加入VEGF165基因納米粒子；6個孔中加入VEGF165裸質粒；6個孔為空白對照組，培養(yǎng)48h。應用RT-PCR法檢測VEGFmRNA水平，應用ELISA法檢測VEGF蛋白表達水平，觀察納米基因

5、載體為真核細胞傳遞基因的可行性。 3.心肌細胞吞噬VEGF基因納米粒子的形態(tài)學研究制備納米粒子懸浮液，采用成年新西蘭兔4只，3％戊巴比妥納(1ml/kg)經(jīng)耳緣靜脈麻醉，逐層暴露心臟。用微量注射器直視下向心肌內注射VEGF165基因納米粒子懸浮液0.8ml。96h后心肌注射部位取材，固定切片，透射電鏡下觀察。評價其向心肌組織內傳遞基因的可行性。 4.VEGF基因納米粒子對心肌缺血的療效觀察。建造兔急性心肌缺血模型，隨機分

6、為三組，納米粒子組(n=12)心肌內注射VEGF165納米粒子，裸質粒組(n=12)注射VEGF165裸質粒，對照組(n=8)注射生理鹽水。術后1月對實驗動物進行心臟超聲檢查，觀察心功能改善情況，取注射部位的心肌組織，Ⅷ因子相關抗原染色，觀察心肌組織中毛細血管生成情況。 結果: 1.成功制備VEGF165基因納米粒子(1)包封率為：88.4％。(2)載藥率為：1.87％。(3)體外測定DNA釋放情況為：最初24h有24.

7、9％/24h±4.3％/24h(n=4)的DNA被釋放出來，隨后的4d內以7.2％/24h±2.3％/24h的速率釋放，然后維持1.6％/24h±0.5％/24h的速率釋放，持續(xù)觀察14d后DNA釋放終止。(4)電鏡觀察納米粒子的粒徑在50-300nm之間。 2.VEGF165基因納米粒子可體外轉染心肌細胞RT-PCR結果顯示納米粒子組可見特異性條帶，裸質粒組、對照組無此特異性條帶，這說明納米粒子可將VEGF基因導入心肌細胞。E

8、LISA法檢測結果顯示，納米粒子組的細胞上清中VEGF蛋白質量濃度為385ng/l±46ng/l，而裸質粒組與空白對照組則未檢測到VEGF蛋白。 3.心肌細胞內可見被吞噬的納米粒子心肌細胞胞質內及胞核內可見大量被吞噬的納米粒子，部分位于線粒體間或吸附于線粒體膜上。部分納米粒子位置靠近核膜或附于核膜上，并且有些已被核膜包裹。 4.VEGF基因納米粒子治療心肌缺血的療效術后1月納米粒子組較其它兩組在室壁運動及左室射血分數(shù)改善

9、明顯，具有統(tǒng)計學意義。納米粒子組、裸質粒組及對照組心肌內毛細血管數(shù)分別為(57±12)、(41±14)及(24±8)，各組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。 結論:成功構建了VEGF165基因納米粒子，納米粒子可用于VEGF165基因的攜帶、轉染和表達，體內實驗證實心肌細胞完全可以通過吞噬方式大量攝取VEGF165納米粒子，VEGF165納米粒子做為向心肌細胞轉運的基因的載體是可行的，與裸質粒介導的基因轉染相比，VEGF