抗GPC3抗體的篩選及其抗肝細胞腫瘤活性研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3；GPC3）在原發(fā)性肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma；HCC）、癌旁慢性淺表性胃炎組織中表達,而在膽管細胞癌和良性肝病以及正常肝組織中無表達。因此，GPC3成為臨床診斷和治療的一個新的潛在靶點。與原核細胞展示型抗體庫相比，利用哺乳動物細胞膜展示型抗體庫進行抗體的篩選獲得的修飾后單鏈抗體(Single Cha

2、in Fragment Variable；scFv)具有更好的特異性和低免疫原性。與單鏈抗體相比，全長抗體具有穩(wěn)定性高和半衰期長的特點，其具有Fc段（Fragment Crystallizable）可與含有Fc段的靶細胞結(jié)合介導細胞免疫，同時也可激活補體介導的細胞免疫。因此，全長全人源的抗GPC3抗體在原發(fā)性肝癌的診斷和治療上具有巨大的潛力。
　　第一部分：全人源肝癌 scFv抗體庫的建立
　　在本實驗室自主構(gòu)建的哺乳動物細

3、胞膜展示型scFv抗體庫[1]的基礎上，增加9例肝癌病人血樣進行scFv抗體庫的擴庫。其主要流程為：1）提取病人外周血中的淋巴細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），并從其中提取總核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）；2）以RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄獲得互補脫氧核糖核苷酸（complementary DNA，cDNA）；3）通過參考文獻設計輕重鏈引物，以cDNA為模板，進行聚合酶

4、鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)獲得輕重鏈抗體的可變區(qū)（variable region of heavy chain，VH；variable region of light chain，VL）；4）通過重疊PCR（overlap extention PCR）將輕重鏈基因序列連接在一起，形成單鏈抗體；5）構(gòu)建pDisplay-scFv質(zhì)?？贵w庫。將肝癌pDisplay-scFv抗體庫的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后挑取單

5、克隆進行測序。通過測序結(jié)果進行肝癌scFv抗體庫的活性、多樣性的鑒定和庫容量的估算。通過流式細胞術和Western Blotting實驗對肝癌pDisplay-scFv抗體庫質(zhì)粒的表達進行鑒定。綜上所述，我們構(gòu)建了一個具有活性和多樣性、庫容量約為6.4×104、可在哺乳動物細胞膜表面進行表達的肝癌pDisplay-scFv抗體庫。
　　第二部分：流式細胞分選
　　將抗體庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后，通過FITC標記的GPC3蛋白

6、對表達GPC3 scFv抗體的陽性細胞進行分選。通過肝癌scFv抗體庫與非肝癌scFv抗體庫的流式細胞分選進行比較，證明增加肝癌scFv抗體庫的庫容量有利于GPC3 scFv抗體的分選。采用三輪流式細胞分選，利用GPC3蛋白濃度的梯度遞減（10 nM、5 nM、1 nM）來獲得親和力更高的scFv候選序列。獲得的候選序列與已有序列的同源性為85％-95%。
　　第三部分：抗GPC3全長抗體的構(gòu)建
　　將輕重鏈序列構(gòu)建進入HX

7、T1以及HXT2載體，完成HXT1-VH和HXT2-VL表達質(zhì)粒的構(gòu)建。將HXT1-VH和HXT2-VL質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293E細胞后，取細胞上清進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色鑒定抗體大??；通過Western Blotting鑒定抗體為IgG型抗體；采用Protein A親和柱層析法進行抗體的純化。
　　第四部分：抗體的活性評價
　　通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent ass

8、ay，ELISA)證明抗體與GPC3具有結(jié)合活性；使用NTA sensor通過Fortebio測得GPC3蛋白與抗體的親和常數(shù)（KD）約為1.4×10-6 M。采用不同濃度（0μg/mL，40μg/mL，200μg/mL）的抗體孵育Huh-7細胞和HepG2細胞后進行增殖實驗和劃痕實驗。采用0μg/mL和150μg/mL的抗體孵育Huh-7細胞和HepG2細胞后進行細胞周期實驗。采用0μg/mL和100μg/mL的抗體孵育Huh-7細胞

9、和HepG2細胞后進行凋亡實驗。結(jié)果顯示，抗體對Huh-7細胞和HepG2細胞具有抑制其增殖、遷移和黏附的作用；調(diào)控Huh-7細胞和HepG2細胞的細胞周期；促進Huh-7細胞和HepG2細胞的凋亡。
　　結(jié)合功能實驗結(jié)果，采用150μg/mL的抗體孵育Huh-7細胞和HepG2細胞，檢測相關增殖、凋亡、遷移和黏附等關鍵分子的基因和靶基因mRNA水平的變化。qPCR結(jié)果顯示，MMP2、MMP9、HGF等表型基因的表達水平受到不同程

10、度的抑制，從而在mRNA水平驗證了細胞水平的活性實驗結(jié)果。
　　第五部分：抗體作用機制的初步探索
　　1）抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity；ADCC）
　　以PBMC細胞為效應細胞，使用200μg/mL的濃度孵育Huh-7細胞和HepG2細胞12h后進行活細胞檢測。結(jié)果顯示，抗體組PBMC對Huh-7細胞和HepG2細胞具有明顯

11、殺傷效果。
　　2）Wnt信號通路
　　使用150μg/mL的抗體孵育Huh-7細胞和HepG2細胞，檢測Wnt信號通路關鍵基因mRNA水平的變化。qPCR結(jié)果顯示，抗體對GPC3和β-catenin基因的表達水平有抑制作用但是無統(tǒng)計學差異；對Wnt3α和Wnt1基因的表達水平具有明顯的抑制作用。經(jīng)過對GPC3、Wnt3α和β-catenin的Western Blotting實驗驗證上述mRNA水平表達結(jié)果。目前，初步推斷抗