黃芩苷促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞向功能性心肌細(xì)胞分化及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、背景:
　　胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ES細(xì)胞)是一類可進(jìn)行自我更新的細(xì)胞,在一定條件下能夠向骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)等多個(gè)胚層的組織細(xì)胞分化。多項(xiàng)研究表明,ES細(xì)胞移植入缺血心臟后可以分化形成新生心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等,還可以通過(guò)分泌多種生長(zhǎng)因子,促進(jìn)微循環(huán)建立,增加血流的灌注,提高梗死后心臟的功能。將ES細(xì)胞的多向分化特性應(yīng)用于臨床治療,可能為心肌梗死后的慢性心力衰竭患者帶來(lái)新的希望。

2、　　ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可以被誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞,具備心肌細(xì)胞的表型,表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物,甚至有自發(fā)跳動(dòng)現(xiàn)象。ES細(xì)胞源心肌細(xì)胞是再生醫(yī)學(xué)中治療心肌梗死導(dǎo)致的心力衰竭等心臟疾病的很有前景的細(xì)胞來(lái)源。但是ES細(xì)胞在體外自然分化為心肌樣細(xì)胞的效率很低,研究者已經(jīng)研究了用很多誘導(dǎo)因子在體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化,盡管取得了不少成就,但還是未能達(dá)到臨床移植治療心肌疾病所需要的細(xì)胞的數(shù)量和純度。如何進(jìn)一步提高ES細(xì)胞源心肌細(xì)胞的分化率

3、以確保充足的心肌細(xì)胞來(lái)源是目前亟需解決的首要問(wèn)題。尋找新的更有效、更安全、更經(jīng)濟(jì)的誘導(dǎo)劑仍是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。傳統(tǒng)中藥的活性成分黃芩苷(baicalin)具有抗氧化、抗炎、保護(hù)缺血后受損的心肌細(xì)胞的作用,臨床上已經(jīng)廣泛運(yùn)用于治療各種心血管疾病的治療。本課題旨在研究黃芩苷對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞(murine embryonic stem cells, mES細(xì)胞)向心肌細(xì)胞分化的作用及其調(diào)控機(jī)制。
　　胚胎干細(xì)胞分化是外界刺激和細(xì)胞

4、內(nèi)特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控的共同作用的結(jié)果。ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化過(guò)程類似胚胎時(shí)期的表現(xiàn),心肌發(fā)育相關(guān)調(diào)控基因在這一過(guò)程中會(huì)被激活,但其表達(dá)規(guī)律還有待進(jìn)一步闡明。結(jié)合現(xiàn)有的中藥誘導(dǎo) ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的研究現(xiàn)狀,我們希望通過(guò)使用黃芩苷誘導(dǎo)ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn),試圖在以下幾個(gè)方面有所發(fā)現(xiàn):(1)黃芩苷能否誘導(dǎo) mES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化?(2)在誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)心肌細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)有何差異?(3)黃芩苷在影響 ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞

5、分化的過(guò)程中具體影響到了哪些調(diào)控心肌分化的信號(hào)通路?希望通過(guò)上述問(wèn)題的研究闡明 ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響因素,為提高心肌細(xì)胞的分化比率提供理論依據(jù),加快ES細(xì)胞源心肌細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用進(jìn)程。
　　目的:
　　1.觀察黃芩苷對(duì)mES細(xì)胞增殖的影響;
　　2.觀察黃芩苷對(duì)分化后不同時(shí)間點(diǎn)胚體生長(zhǎng)的影響;
　　3.分別研究經(jīng)黃芩苷處理后不同分化時(shí)間點(diǎn)的心肌特異性標(biāo)志物在 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化;
　

6、　4.研究調(diào)控心肌分化的各信號(hào)通路的相關(guān)基因在黃芩苷處理后不同分化階段的表達(dá)變化,揭示黃芩苷影響心肌分化的可能作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用MTT(四甲基偶氮苯唑鹽)法檢測(cè)不同濃度的黃芩苷處理對(duì) mES細(xì)胞增殖能力的影響,篩選最佳有效濃度用于誘導(dǎo) mES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。
　　2.mES細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng):
　　采用經(jīng)典的“懸滴-懸浮-貼壁”三步法,持續(xù)用終濃度為10μmol/L和50μmol/L黃芩

7、苷誘導(dǎo) mES細(xì)胞分化。每2天更換一次培養(yǎng)基,并保持分化過(guò)程中培養(yǎng)基始終維持相同的藥物濃度。
　　3.形態(tài)學(xué)觀察:
　　鏡下觀察 mES細(xì)胞克隆的形態(tài)。誘導(dǎo)分化后,用倒置顯微鏡連續(xù)觀測(cè)胚體(embryoid bodies,EBs)的直徑和含跳動(dòng)區(qū)域的EBs數(shù)占總 EBs數(shù)的百分比。4.流式細(xì)胞檢測(cè):
　　應(yīng)用Phycoerythrin(PE)標(biāo)記的抗體分別檢測(cè)分化第10、16、20天的EBs的心肌細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率

8、,即α-sarcomeric-actinin標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。
　　5.免疫熒光檢測(cè):
　　分化第16天,用免疫熒光染色法檢測(cè)分化出的心肌樣細(xì)胞的心肌特異性的標(biāo)志物α-肌小節(jié)輔肌動(dòng)蛋白(α-sarcomeric-actinin)和心室肌特異性肌球蛋白輕鏈2(Myosin light chain-2,ventricular,MLC-2v)的表達(dá)。
　　6.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

9、應(yīng)(real-time PCR)檢測(cè):
　　分別在分化后第2、4、6、8、10、12、14、16、20天時(shí)提取樣本總 RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)得到 cDNA,用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照基因,通過(guò) RT-PCR和real-time PCR檢測(cè)三個(gè)胚層標(biāo)志物如Sox17、PECAM和NCAM,心肌轉(zhuǎn)錄因子如Nkx2.5、MEF2c、TBX5、GATA4,心肌特異性基因如α-心肌肌球蛋白重鏈(Myosin hea

10、vy chain,α-MHC)、MLC-2v、心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和HCN4(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel4),及心肌發(fā)育調(diào)控信號(hào)通路相關(guān)基因如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP2、BMP4、Wnt11、Wnt3a的mRNA表達(dá)水平。
　　7.免疫印跡(western blo

11、t)檢測(cè):
　　分別取分化第10、16、20天的胚體,提取細(xì)胞的總蛋白,經(jīng)過(guò) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、ECL顯色曝光等步驟,檢測(cè)心肌特異性標(biāo)志蛋白α-actinin、MLC-2v的表達(dá)。
　　8.膜片鉗記錄:
　　利用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞的電生理學(xué)特性和激素調(diào)節(jié)反應(yīng)性。
　　結(jié)果:
　　不同濃度的黃芩苷對(duì) mES細(xì)胞的增殖均有抑制作用,此抑制作用

12、呈濃度依賴性。在分化的過(guò)程中,黃芩苷處理組的EB直徑顯著小于對(duì)照組。但是50μmol/L黃芩苷明顯地提高了mES細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化比例,表現(xiàn)在:(1)黃芩苷提高了中晚期跳動(dòng)胚體的比例。(2)黃芩苷提高了α-actinin陽(yáng)性細(xì)胞的比例。(3)分化中后期,心肌特異性標(biāo)志物α-MHC、MLC-2v及ANP的mRNA水平在黃芩苷組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。免疫熒光結(jié)果顯示在對(duì)照組和黃芩苷處理組得到的mES細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞中都有心肌特異性的蛋白

13、α-actinin和MLC-2v的表達(dá)。膜片鉗記錄結(jié)果顯示分化出來(lái)的心肌細(xì)胞中存在著起搏樣細(xì)胞、心房樣細(xì)胞、心室樣細(xì)胞。黃芩苷處理組中的心房及心室樣心肌細(xì)胞的比例高于空白對(duì)照組,起搏樣細(xì)胞的比例低于對(duì)照組。除了起搏樣細(xì)胞和心室樣細(xì)胞的跳動(dòng)頻率在黃芩苷組高于對(duì)照組外,其他的動(dòng)作電位參數(shù)在兩組間沒(méi)有明顯的差異。黃芩苷誘導(dǎo)出的心肌細(xì)胞具有了完整的激素調(diào)節(jié)功能。檢測(cè)的心肌轉(zhuǎn)錄因子中,僅有Nkx2.5在分化晚期被黃芩苷上調(diào),其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)未明

14、顯受到黃芩苷處理的影響。黃芩苷在分化中期上調(diào)Wnt3a的表達(dá),然而在分化晚期,黃芩苷則明顯地抑制了Wnt3a的表達(dá),黃芩苷對(duì)檢測(cè)的其他調(diào)控心肌發(fā)育的基因mRNA水平?jīng)]有產(chǎn)生明顯的影響。
　　結(jié)論:
　　1.黃芩苷抑制mES細(xì)胞的增殖,此抑制作用具有濃度依賴性。
　　2.黃芩苷(50μmol/L)可以促進(jìn)mES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞,此促進(jìn)作用主要表現(xiàn)在分化晚期。
　　3.黃芩苷促進(jìn)mES細(xì)胞向心房肌和心室肌細(xì)胞分化,