XIAP,SOD2和MMP-2在膀胱癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分XIAP RING結(jié)構(gòu)域通過介導(dǎo)miRNA-4295表達進而抑制p63α的表達和促進膀胱上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化
　　一、背景和目的:
　　X連鎖的細胞凋亡蛋白抑制因子(XIAP)是IAP家族的一員，是一種潛在的細胞凋亡抑制因子。據(jù)報道XIAP在急性、慢性白血病，前列腺癌和很多其他癌癥中均程高表達，提示XIAP的過表達和可能與癌癥的發(fā)展相關(guān)。最近，我們的研究表明XIAP存在一些與細胞凋亡無關(guān)的功能，包括周期蛋白D1的上調(diào)后促

2、進膀胱癌細胞的生長和抑制RhoGDIα的賴氨酸138位點的SUMO化來促進F肌動蛋白的形成和結(jié)腸癌細胞的侵襲等。另有其他的研究報道XIAP過表達和癌癥患者的癌癥發(fā)展，藥物抵抗和不良預(yù)后相關(guān)。
　　XIAP其氨基末端有三個重復(fù)的BIR結(jié)構(gòu)域，和羧基末端的RING結(jié)構(gòu)域。BIR結(jié)構(gòu)域可抑制半胱天冬酶3、7和9，主要負責(zé)XIAP抑制細胞凋亡的功能，羧基末端的RING結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)出E3泛素連接酶的活性，使IAP通過蛋白酶體引起自身泛素化，

3、半胱天冬酶3，7泛素化。近來，我們發(fā)現(xiàn)XIAP的BIR結(jié)構(gòu)域能夠直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F1并增加它的反式激活能力。相反，XIAP RING結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能和分子機制尚不完全清楚。我們之前的報道闡明了RING結(jié)構(gòu)域具有抑制RhoGDIα的賴氨酸138位點的泛素化和抑制F肌動蛋白形成和人結(jié)腸癌細胞侵襲等部分功能。
　　在腫瘤抑制基因P53發(fā)現(xiàn)的20年間，我們又發(fā)現(xiàn)了p63和p73基因。p63蛋白是轉(zhuǎn)錄因子p53蛋白家族的成員之一，對上

4、皮組織的發(fā)展非常重要。現(xiàn)已經(jīng)表明p63基因缺陷的小鼠存在一些發(fā)育缺陷，缺少四肢、牙齒和乳腺等。p63基因通過不同的啟動子編碼兩種主要的異構(gòu)體，TAp63和△Np63，具有不同的轉(zhuǎn)錄能力。TAp63包含一個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(TAD)，可啟動p53相關(guān)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，例如p21、bax、mdm2和其他特異的靶基因，然而△Np63缺乏轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(TAD)。盡管腫瘤的形成機制尚未完全清楚，但仍有報道稱p63的缺失可導(dǎo)致自發(fā)性腫瘤的形成。p63

5、α是p63最長的TA轉(zhuǎn)錄組變體，作為腫瘤抑制因子阻止癌癥的發(fā)展。然而，大部分已有的研究主要集中于p63α調(diào)控的下游效應(yīng)因子，對于p63α的上游調(diào)控機制了解很少。這激發(fā)我們開展目前的研究工作。
　　本課題的研究讓我們更加深入的了解XIAP及其RING結(jié)構(gòu)域和p63α在膀胱上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用，并為膀胱癌預(yù)防和治療提供一些潛在的新靶點。
　　二、方法:
　　1.體內(nèi)外實驗共同研究XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)63α的調(diào)控

6、:
　　首先體外實驗，在正常膀胱上皮細胞系UROtsa中轉(zhuǎn)染特異性敲減XIAP的shRNA，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株后檢測p63α的表達情況，另外，在UROtsa中分別過表達XIAP(△BIR)和XIAP(△RING)結(jié)構(gòu)域，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系后檢測p63α的表達情況。其次在體內(nèi)實驗，利用RING缺失的XIAP敲入小鼠，提取小鼠的膀胱上皮細胞，通過WB檢測p63α的表達情況。
　　2.細胞非貼壁依賴性實驗檢測XIAP RING結(jié)構(gòu)域和

7、p63α對膀胱上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的影響:
　　利用EGF可以誘導(dǎo)UROtsa細胞惡性轉(zhuǎn)的細胞模型，對XIAP RING結(jié)構(gòu)域和p63α在誘導(dǎo)膀胱上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用，用已經(jīng)建立好的UROtsa敲減XIAP和相應(yīng)對照的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞做細胞非貼壁依賴性實驗，用EGF誘導(dǎo)其惡性轉(zhuǎn)化，明確XIAP對細胞惡性轉(zhuǎn)化的作用。利用UROtsa中分別過表達XIAP(△BIR)和XIAP(△RING)結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)對照組做細胞非貼壁依賴性實驗，確定是由

8、XIAP的哪個結(jié)構(gòu)域參與了對膀胱上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)控。因為UROtsa中過表達XIAP(△BIR)后p63α升高，在此過表達XIAP(△BIR)中轉(zhuǎn)染特異性敲減p63α的shRNA和它的對照組Nonsense，并建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，比較這兩株細胞系對EGF誘導(dǎo)上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的影響。
　　3.XIAP RING結(jié)構(gòu)域影響p63α表達的分子機制研究:
　　利用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測UROtsα中敲減XIAP和UROtsa中過表達XIA

9、P(△BIR)與其相應(yīng)對照組細胞間p63αmRNA的表達情況。利用蛋白翻譯抑制劑CHX處理UROtsα中敲減XIAP和UROtsa中過表達XIA P(△BIR)與其相應(yīng)對照組細胞，抑制p63α的翻譯后，比較p63α的降解速率。利用35S標(biāo)記蛋氨酸，半胱氨酸標(biāo)記新合成的蛋白，通過用特異性抗p63α的抗體沉淀p63α，并通過放射自顯影檢測比較UROtsa中敲減XIAP和對照細胞組間新和成的p63α的速率。利用螢光素酶報告載體，將p63α的3

10、'UTR區(qū)域通過PCR構(gòu)建至pmir-report載體中，將帶有p63α3'UTR的螢光素酶報告載體和TK一起轉(zhuǎn)入UROtsa敲減XIAP和相應(yīng)對照細胞，UROtsa中過表達XIAP(△BIR)結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)對照細胞，以TK為內(nèi)參，比較p63α3'UTR活性的改變。
　　4.分析XIAP RING結(jié)構(gòu)域調(diào)控的可以影響p63α翻譯的miRNA:
　　利用在線分析網(wǎng)站targetscan分析可以結(jié)合到p63α3'UTR的miRNA

11、，合成相應(yīng)的miRNA的引物，通過實時熒光定量PCR，比較這些miRNA在UROtsa敲減XIAP和相應(yīng)對照細胞，UROtsa中過表達XIAP(△BIR)結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)對照細胞中的差別，從而篩選出可能可以結(jié)合到p63α3'UTR并調(diào)控p63α翻譯的miRNA。通過在UROtsa中過表達該miRNA，用實時熒光定量PCR檢測過表達效率，用WB檢測該miRNA過表達后對p63α的影響，而從明確該miRNA參與XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)63α

12、翻譯的調(diào)節(jié)。
　　5.驗證調(diào)節(jié)p63α翻譯的miR-4295對膀胱上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的影響:
　　用細胞非貼壁依賴性實驗檢測UROtsa中過表達該miRNA后對EGF誘導(dǎo)的上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的影響，而從明確miR-4295參與XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)63α翻譯的調(diào)節(jié)和上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的影響。
　　6.XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)φ{(diào)節(jié)p63α翻譯的miR-4295調(diào)控分子機制研究:
　　利用NCBI分析miR-429

13、5在基因組上的具體位置，主要分析miR-4295是獨立表達還是和某個宿主基因一起表達。利用反轉(zhuǎn)錄PCR比較miR-4295宿主基因VTI1A在UROtsa敲減XIAP和相應(yīng)對照細胞，UROtsa中過表達XIAP(△BIR)結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)對照細胞中的差別，從而明確XIAP RING結(jié)構(gòu)域調(diào)控miR-4295的可能途徑。
　　三、結(jié)果:
　　1.在體內(nèi)外的膀胱上皮細胞中，XIAP可通過其RING結(jié)構(gòu)域特異的抑制p63α蛋白表達。<

14、br>　　WB結(jié)果表明XIAP能抑制p63α蛋白的表達。異源表達HA-△BIR可抑制UROtsa細胞中p63α蛋白的表達，而過表達HA-△RING并沒有顯示這些生物學(xué)功能。在XIAP△RING結(jié)構(gòu)域基因敲入小鼠中證實了XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)63α表達的抑制效應(yīng)，表明p63α蛋白的表達在XIAP△RING基因敲入小鼠的膀胱上皮細胞中比XIAP-WT小鼠更高，在XIAP△RING基因敲入的小鼠中發(fā)現(xiàn)p63α表達上調(diào)。我們的結(jié)果表明了，

15、XIAP的RING結(jié)構(gòu)域?qū)w內(nèi)外膀胱上皮細胞中p63α蛋白的表達都起了抑制效應(yīng)。
　　2.p63α的下調(diào)對XIAP RING結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的人膀胱上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。
　　細胞非貼壁依賴性實驗證明了，XIAP促進人膀胱上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化主要是通過其RING結(jié)構(gòu)域，在UROtsa穩(wěn)定過表達HA-△BIR結(jié)構(gòu)域的細胞中再轉(zhuǎn)入p63α過表達的質(zhì)粒，比較其細胞非貼壁依賴性生長能力，發(fā)現(xiàn)p63α回轉(zhuǎn)后可明顯抑制UROtsa穩(wěn)定過表

16、達HA-△BIR結(jié)構(gòu)域的細胞的受EGF誘導(dǎo)的細胞非貼壁依賴性生長的能力，表明了p63α的下調(diào)對XIAP RING結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的人膀胱上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。
　　3.XIAP RING結(jié)構(gòu)域抑制人膀胱UROtsa細胞中p63α蛋白的翻譯。
　　反轉(zhuǎn)錄PCR比較UROtsa(shXIAP)和UROtsa(HA-△BIR)與對照組細胞UROtsa(Nonsense)和UROtsa(Vector)中p63α的mRNA水平，顯示并

17、無顯著差別，蛋白合成抑制劑CHX作用下，在UROtsa(shXIAP)和UROtsa(Nonsense)中檢測p63α蛋白的降解速率。結(jié)果顯示，p63α蛋白在UROtsa(shXIAP)細胞中的降解速率比UROtsa(Nonsense)中的要快。短期的蛋白合成脈沖標(biāo)記實驗比較UROtsa(shXIAP)和UROtsa(Nonsense)細胞中p63α的蛋白翻譯速率，35S標(biāo)記的甲硫氨酸和半胱氨酸用來新合成p63α蛋白，相同時間內(nèi)UROt

18、sa(shXIAP)細胞合成的新蛋白比UROtsa(Nonsense)明顯增加。說明XIAP RING結(jié)構(gòu)域抑制人膀胱UROtsa細胞中p63α蛋白的表達在翻譯水平。
　　4.miR-4295通過靶向結(jié)合p63α mRNA3'UTR來介導(dǎo)RING結(jié)構(gòu)域抑制p63α的蛋白翻譯。
　　用p63α3'UTR熒光素酶報告載體比較p63α3'UTR UROtsa(Nonsense)和UROtsa(shXIAP)細胞，UROtsa(Ve

19、ctor)和UROtsa(HA-△BIR)細胞中的活性，XIAP敲減后顯著提高了p63α3'UTR的活性，而異源表達HA-△BIR顯著抑制了p63α3'UTR的活性，揭示了XIAP RING結(jié)構(gòu)域通過作用于p63α mRNA的3'UTR抑制p63α蛋白的翻譯。在線Targetscan6.2軟件來分析miR-4295能結(jié)合p63α mRNA3'UTR，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示miR-4295的表達在UROtsa(shXIAP)細胞中是受

20、抑制的，而在UROtsa(HA-△BIR)中是顯著上升的，miR-4295的表達和預(yù)期調(diào)控p63αmRNA的3'UTR活性是一致的，結(jié)果提示了miR-4295通過靶向結(jié)合p63α mRNA3'UTR來介導(dǎo)RING結(jié)構(gòu)域抑制p63α的蛋白翻譯。
　　5.miR-4295介導(dǎo)RING結(jié)構(gòu)域促進UROtsa細胞的惡性轉(zhuǎn)化。
　　我們構(gòu)建了過表達miR-4295的質(zhì)粒并和p63α3'UTR熒光素酶報告載體一起穩(wěn)定轉(zhuǎn)入UROtsa細胞

21、，UROtsa細胞過表達miR-4295后p63α3'UTR活性明顯被抑制，同時WB檢測p63α的蛋白表達量也明顯下降，細胞非貼壁依賴性實驗發(fā)現(xiàn)UROtsa細胞中過表達miR-4295以后可明顯增加EGF誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化能力。結(jié)果提示了miR-4295介導(dǎo)XIAP RING結(jié)構(gòu)域促進UROtsa細胞的惡性轉(zhuǎn)化。
　　6.XIAP的RING結(jié)構(gòu)域通過上調(diào)Sp1蛋白的表達和轉(zhuǎn)錄活性進而促進miR-4295轉(zhuǎn)錄。
　　NCBI數(shù)據(jù)

22、庫比對找到了miR-4295的宿主基因，結(jié)果顯示miR-4295的前體由VTI1A基因的內(nèi)含子區(qū)域編碼。反轉(zhuǎn)錄PCR和WB檢測敲低XIAP基因后VTI1A的表達名明顯受抑制，然而過表達HA-△BIR提高了VTI1A的蛋白和mRNA水平的表達。VTI1A啟動子熒光素酶報告載體比較兩對細胞UROtsa(Nonsense)細胞和UROtsa(shXIAP)細胞，UROtsa(vector)細胞和UROtsa(HA-△BIR)細胞中VTI1A啟

23、動子，結(jié)果顯示，VTI1A啟動子熒光報告基團的轉(zhuǎn)錄活性在UROtsa(shXIAP)細胞中顯著下調(diào)，在UROtsa(HA-△BIR)細胞中上調(diào)，表明XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)TI1A和miR-4295的調(diào)控在轉(zhuǎn)錄水平。比較可結(jié)合至VTI1A啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子的表達情況，發(fā)現(xiàn)Sp1的表達水平及活性與VTI1A啟動子活性一致，提示XIAP的RING結(jié)構(gòu)域通過上調(diào)Sp1蛋白的表達和轉(zhuǎn)錄活性來促進miR-4295轉(zhuǎn)錄。
　　四、結(jié)論:

24、
　　在目前的研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)敲減XIAP的表達后可誘導(dǎo)p63α蛋白的上調(diào)，然而在正常膀胱上皮細胞中過表達XIA(△BIR)后可下調(diào)p63α的表達。這與RING缺失的XIAP敲入小鼠的膀胱組織中的表現(xiàn)一致，證明了XIAP RING結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)外膀胱上皮細胞對p63α表達的新型抑制效應(yīng)。我們接下來的功能研究也揭示了，XIAP RING結(jié)構(gòu)域?qū)63α蛋白表達的抑制，對表皮生長因子誘導(dǎo)人正常膀胱上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化非常重要。進一步的

25、機制研究揭示了XIAP RING結(jié)構(gòu)域能夠啟動miR-4295的轉(zhuǎn)錄，而miR-4295可以靶向作用于p63αmRNA的3，UTR，從而抑制p63α蛋白的翻譯。而且，XIAP RING在人膀胱上皮細胞中上調(diào)Sp1蛋白對miR-4295的轉(zhuǎn)錄表達非常重要，Sp1作為轉(zhuǎn)錄因子可以激活miR-4295的宿主基因VTI1A的轉(zhuǎn)錄，從而增加miR-4295的表達量?？偟膩碚f，我們的研究揭示了XIAP RING結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)外的一個新功能，即通過上調(diào)

26、Sp1表達來增加miR-4295的轉(zhuǎn)錄，從而降低p63α蛋白的翻譯，最終導(dǎo)致及膀胱上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　第二部分膀胱癌非轉(zhuǎn)移性細胞系T24和其轉(zhuǎn)移性衍生態(tài)T24T在細胞侵襲和遷移能力的不同表現(xiàn)及具體機制研究
　　一、背景和目的:
　　癌細胞遷移和浸潤能力的獲得是發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。先前的研究認為遷移和浸潤時具有相同的生物學(xué)意義，但我們最近的研究結(jié)果顯示它們是兩個不同的事件。細胞遷移包含大量步驟:細胞與細胞間黏附的消失、細

27、胞膜向運動方向突出，前端和尾端與細胞外基質(zhì)黏著解離，肌動蛋白細胞骨架收縮驅(qū)動胞體向前。癌細胞的轉(zhuǎn)移同樣包含很多步驟:滲入連接組織、進入血液和免疫系統(tǒng)、在遠隔器官形成一個新的腫瘤。
　　超氧化物歧化酶(SOD)是一種能夠催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫的酶。線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生有毒的超氧化物，SOD2可將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫和二價氧，并參與活性氧的反應(yīng)過程。最近的研究顯示，SOD2在高級別和晚期膀胱癌中持續(xù)增加并在癌癥的發(fā)展

28、和轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用。Rho-GTPases包括CDC42和Rac1，它們在調(diào)控細胞遷移過程中發(fā)揮著重要作用，參與黏附、附著解離、去黏附、極化和細胞骨架機化。由于CDC42和Rac1在細胞遷移中的重要性，細胞中這些GTPases自然平衡的打亂最終將導(dǎo)致表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移表型。SOD2、CDC42/Rac1和JNK/c-Jun已被大家熟知參與癌癥的發(fā)展和遷移。然而，SOD2、CDC42/Rac1和JNK/c-Jun在膀胱癌浸潤和遷移中的作用仍然未

29、知。
　　細胞外基質(zhì)的水解對癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移十分重要，腫瘤細胞通過分泌蛋白如MMP-2和MMP-9來促進水合作用。MMP-2也被稱為72KDa的Ⅳ型膠原酶，降解基底膜的一個主要結(jié)構(gòu)成分Ⅳ型膠原。MMP-2被報道參與多數(shù)癌癥的轉(zhuǎn)移，包括結(jié)直腸癌、卵巢癌和乳腺癌等，但與膀胱癌的關(guān)系尚不明確。
　　為了探究參與膀胱癌細胞遷移和浸潤的這些分子的生物學(xué)意義，我們對比研究了一對具有不同轉(zhuǎn)移特征的同源的膀胱癌細胞系T24和T24T的遷移

30、和浸潤能力和它們潛在的機制。雖然T24細胞具有有限的轉(zhuǎn)移能力，但其衍生細胞系T24T細胞具有較強的轉(zhuǎn)移能力。檢測上述分子在T24和T24T細胞中蛋白和mRNA的表達水平，并探究這些蛋白質(zhì)間的潛在關(guān)系。本課題為研究膀胱癌細胞遷移和浸潤的分子基礎(chǔ)提供了新的觀點，揭示了針對膀胱癌細胞轉(zhuǎn)移的新的治療靶點。
　　二、方法:
　　1.比較高度轉(zhuǎn)移的人膀胱癌T24T細胞和其同源T24細胞中遷移與浸潤能力。
　　利用劃痕修復(fù)實驗，比較

31、人膀胱癌T24T細胞和其同源T24細胞間的遷移能力，通過細胞浸潤實驗，比較人膀胱癌T24T細胞和其同源T24細胞間的細胞浸潤能力
　　2.T24T比T24具有較低遷移能力的分子機制研究。
　　WB分析可能的可以參與調(diào)節(jié)細胞遷移的小GTP酶CDC42、Rac1、RhoA和SOD2的表達水平。利用realtime-PCR檢測CDC42和Rac1的mRNA水平。將特異性靶向SOD2的小發(fā)夾RNA(shSOD2)轉(zhuǎn)染到T24T細胞中

32、，比較T24T(nonsense)和T24T(shSOD2)細胞間的小GTP酶表達水平和細胞遷移能力。
　　3.SOD2抑制T24T細胞遷移能力的分子機制研究。
　　比較T24和T24T，T24T(nonsense)和T24T(shSOD2)細胞間的MAPK通路中的JNK，Erk，p38的表達情況，篩選出受SOD2調(diào)控的某一條通路。并在T24T(shSOD2)細胞中抑制c-Jun后比較對小GTP酶表達水平和細胞遷移能力的影響

33、。
　　4.SOD2受調(diào)控表達的分子機制研究。
　　RT-PCR檢測T24和T24T細胞間SOD2的mRNA水平，從而確定SOD2受調(diào)控是否在mRNA水平。我們把SOD2啟動子驅(qū)動的熒光素酶報告載體轉(zhuǎn)染到T24細胞和T24T細胞中，檢測和比較兩種細胞系中SOD2的啟動子活性和轉(zhuǎn)錄表達能力。用啟動子區(qū)域結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子分析網(wǎng)站分析了能結(jié)合SOD2啟動子區(qū)域的潛在轉(zhuǎn)錄因子。通過敲減相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的表達驗證對SOD2啟動子活性，SOD2

34、mRNA水平，SOD2蛋白水平和細胞遷移能力的影響，從而篩選出調(diào)控SOD2表達的轉(zhuǎn)錄因子。
　　5.T24T比T24具有較高浸潤能力的分子機制研究。
　　首先比較T24T敲減SOD2后對細胞浸潤能力的影響，WB和RT-PCR結(jié)合分析可能的可以參與調(diào)節(jié)細胞浸潤能力的蛋白:MMP-2，MMP-9和VEGE將MMP-2特異性的shRNA轉(zhuǎn)染到T24T細胞，構(gòu)建T24T shMMP-2穩(wěn)定細胞，比較敲減MMP-2以后對細胞浸潤能力的

35、影響。
　　6.MMP-2受調(diào)控表達的分子機制研究。
　　RT-PCR檢測T24和T24T細胞間MMP-2的mRNA水平，從而確定MMP-2受調(diào)控是否在mRNA水平。將MMP-2啟動子驅(qū)動的熒光素酶報告載體轉(zhuǎn)染到T24和T24T細胞中，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子并用于比較MMP-2在這兩種細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性，從而確定MMP-2受調(diào)控是否在轉(zhuǎn)錄水平。用放線菌素D(Act D)處理T24和T24T，抑制其MMP-2的mRNA合成，然后比較MM

36、P-2的mRNA在T24和T24T間的降解速率，WB分析比較可以調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性的蛋白在T24和T24T間的表達情況，通過特異性敲減Nucleolin，檢測其對MMP-2的表達水平的影響和對細胞浸潤能力的影響，從而確定其參與調(diào)節(jié)MMP-2的表達和細胞的浸潤能力。
　　三、結(jié)果:
　　1.高度轉(zhuǎn)移的人膀胱癌T24T細胞較其同源T24細胞具有低遷移能力和高浸潤能力。
　　為了探究T24與T24T細胞的細胞遷移，我們利用劃

37、痕實驗檢測，劃痕36小時后，T24細胞系已經(jīng)完全愈合，而T24T細胞只有部分愈合，表明T24T細胞與T24細胞相比具有較低的遷移能力。細胞浸潤實驗的結(jié)果顯示，與T24細胞相比，T24T提高了其浸潤能力，表明高細胞遷移活性并不一定意味著高浸潤活性。
　　2.SOD2參與抑制T24T細胞遷移。
　　觀察T24和T24T細胞，檢測細胞中小GTP酶CDC42、Rac1和RhoA的表達水平。與T24細胞相比，T24T細胞中CDC42、

38、Rac1和RhoA蛋白表達明顯下降，這些結(jié)果提示了CDC42/Rac1可能參與T24T細胞的細胞遷移抑制。我們檢測了T24和T24T細胞中SOD2的表達情況。結(jié)果顯示，SOD2的表達在T24T細胞中顯著升高，將特異性靶向SOD2的小發(fā)夾RNA(shSOD2)轉(zhuǎn)染到T24T細胞中，與T24T(nonsense)細胞相比，T24T細胞敲減SOD2后，CDC42和Rac1的蛋白和mRNA表達水平升高，同樣增加了細胞遷移活性。
　　3.S

39、OD2通過靶向JNK/AP-1/GTPase通路抑制T24T細胞遷移。
　　對比于T24細胞，T24T細胞中JNK和Erk的磷酸化水平明顯降低而p38僅有輕微降低;然而T24與T24T細胞的JNK、p38和Erk蛋白表達水平相近，T24TshSOD2細胞表現(xiàn)出較高的JNK、Erk和c-JUN活性，而T24T shSOD2細胞中與其空載體對照轉(zhuǎn)染細胞T24T nonsense細胞相比，p38的總體水平和磷酸化水平相近，這些結(jié)果顯示S

40、OD2可抑制JNK、Erk和其下游轉(zhuǎn)錄因子c-JUN/AP-1的功能，p38可能未參與SOD2對細胞遷移的調(diào)節(jié)。將顯性負突變c-Jun突變體TAM67轉(zhuǎn)染到T24T shSOD2細胞中。結(jié)果顯示CDC42/Rac1表達水平和細胞遷移能力顯著下降。利用抑制劑SP600125(特異性針對JNK)和PD98059（特異性針對MEK/Erk）處理T24細胞，檢測表明SOD2是JNKs調(diào)節(jié)c-Jun活化的上游作用因子，而JNKs通過c-Jun來參

41、與SOD2對細胞遷移的調(diào)節(jié)，然而Erk不參與c-Jun介導(dǎo)的T24細胞的細胞遷移。
　　4.轉(zhuǎn)錄因子Sp1過表達介導(dǎo)T24T細胞SOD2的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達。
　　RT-PCR結(jié)果顯示SOD2的mRNA水平在T24T細胞中比T24細胞中高，SOD2啟動子驅(qū)動的熒光素酶報告載體報告在T24T細胞中SOD2啟動子的活性比T24細胞高4倍，揭示了SOD2在T24T細胞中表達增加是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。分析了能結(jié)合SOD2啟動子區(qū)域的潛在轉(zhuǎn)

42、錄因子，包括AP-1，STAT和多位點的Sp1轉(zhuǎn)錄因子。相比較T24細胞，Sp1的表達和Sp-1依賴性的轉(zhuǎn)錄活性在T24T細胞中都是顯著增加的，發(fā)現(xiàn)在T24T敲減Sp1后，細胞中SOD2蛋白水平和mRNA水平的表達都是明顯降低的，相應(yīng)的，SOD2啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性在T24T shSp1細胞中被抑制，同時T24T細胞的細胞遷移能力顯著增加。
　　5.MMP-2表達增加能促進T24T細胞的浸潤。
　　MMP-2在T24T細

43、胞中蛋白水平和mRNA水平都是增加的，而MMP-9在mRNA水平卻是減少的，VEGF并無顯著差異。將MMP-2特異性的shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到T24T細胞后，與其對照組nonsense轉(zhuǎn)染細胞相比，MMP-2的敲低減少了T24T細胞的浸潤能力。
　　6.核仁素增加了MMP-2的mRNA穩(wěn)定性。
　　MMP-2的啟動子轉(zhuǎn)錄活性在T24T細胞和T24細胞間是相當(dāng)?shù)?，放線菌素D(Act D)處理后T24和T24T細胞，RT-PCR結(jié)果

44、顯示，MMP-2在T24T細胞中mRNA的半衰期比T24細胞中更長，揭示了T24T細胞內(nèi)由于MMP-2 mRNA穩(wěn)定性增加MMP-2呈高水平表達?？梢杂绊憁RNA穩(wěn)定性的蛋白AUF1和HuR在T24和T24T細胞中的蛋白表達水平都是相近的，但是核仁蛋白在T24T細胞中是升高的，在用RNA免疫共沉淀RNA-IP分析，結(jié)果顯示核仁蛋白能特異性的結(jié)合到MMP-2 mRNA上，特異性敲減核仁蛋白的表達后，導(dǎo)致了MMP-2表達減少，同時也抑制了細

45、胞的浸潤能力。
　　四、結(jié)論:
　　先前關(guān)于癌細胞浸潤的研究主要集中在它的遷移能力，因為這兩個事件常被認為具有相同生物學(xué)意義，認為腫瘤細胞具有高遷移能力則等同于具有高浸潤能力。而我們的研究發(fā)現(xiàn)T24T細胞比T24細胞具有更高的浸潤能力和較低的遷移能力。T24T細胞與T24細胞相比，Rho-GDPases表達較低而SOD2表達較高。事實上，我們在T24T細胞中敲減SOD2后可明顯降低細胞遷移，而對細胞浸潤能力卻沒有影響。重要的