CARMA3在膀胱癌中的表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf

1、前言
　　膀胱癌是泌尿外科臨床上最常見的腫瘤，在我國(guó)，男性膀胱癌發(fā)病率位于全國(guó)惡性腫瘤的第七位，女性排在第十位以后。約90％的膀胱癌為尿路上皮癌，其中約70％為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，預(yù)后好，但術(shù)后約10％-15％進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌。而浸潤(rùn)性膀胱癌惡性程度較高，常浸潤(rùn)肌層，預(yù)后較差。因此，尋找治療膀胱癌的有效方法，已成為膀胱癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　Caspase募集域和膜相關(guān)鳥苷酸激酶樣結(jié)構(gòu)域蛋白(CARMA)家族是一種支架

2、蛋白，含有CARMA1，CARMA2，CARMA3三個(gè)成員。最近的研究表明，CARMA3在G蛋白偶聯(lián)受體和PKC誘導(dǎo)的NF-κB活化中發(fā)揮重要作用。CARMA3能夠通過招募BCL10、MALT1和TRAF6，誘導(dǎo)NF-κB活化，調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，引起腫瘤惡性進(jìn)展。在乳腺癌，肺癌，腎癌和結(jié)直腸癌中都發(fā)現(xiàn)了CARMA3的致癌作用。但到目前為止，CARMA3在膀胱癌中的作用及其生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。

3、　　本研究旨在檢測(cè)CARMA3在膀胱癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)，探討CARMA3在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為膀胱腫瘤的診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)，也為膀胱癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移機(jī)制研究提供了新的視角。
　　方法
　　1、免疫組化方法檢測(cè)CARMA3在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。
　　收集90位膀胱癌患者標(biāo)本，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)膀胱癌和癌旁組織中的CARMA3的表達(dá)情況。
　　2、Weste

4、rnBlot和Real-timeRT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞系中CARMA3蛋白和mRNA的表達(dá)水平。
　　培養(yǎng)人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1及膀胱癌細(xì)胞系BIU87，T24，5637共四種細(xì)胞，用WesternBlot和Real-timeRT-PCR方法檢測(cè)CARMA3蛋白和mRNA的表達(dá)水平。
　　3、應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染5637和T24細(xì)胞系，應(yīng)用WesternBlot及Real-timeRT-PCR檢測(cè)沉默效率。

5、r>　　瞬時(shí)轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞系5637和T24，實(shí)驗(yàn)設(shè)轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染方法和步驟參照脂質(zhì)體說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，提取總RNA，總蛋白，采用WesternBlot和Real-timeRT-PCR方法檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率。
　　4、CCK-8試劑盒和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后5637和T24細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力。
　　5、應(yīng)用WesternBlot檢測(cè)沉默CARMA3后膀胱癌細(xì)胞中IκB，CyclinD1和Bcl

6、-2的蛋白表達(dá)變化，應(yīng)用Real-timeRT-PCR檢測(cè)沉默CARMA3后膀胱癌細(xì)胞中CyclinD1和Bcl-2的mRNA的變化。
　　6、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)沉默CARMA3后NF-κB的活性改變。
　　結(jié)果
　　1、CARMA3在膀胱癌組織中的表達(dá)情況。
　　(1)38.8％(35/90)膀胱癌組織表達(dá)CARMA3。
　　(2)CARMA3主要定位于細(xì)胞漿中。
　　(3)CARMA3的表達(dá)與膀

7、胱癌的分期(Ta-T1vsT2-T4，P=0.081)相關(guān)
　　(4)CARMA3的表達(dá)與膀胱癌的病理分級(jí)(G1vsG2-G3，P=0.027)有關(guān)
　　2、CARMA3在細(xì)胞系中的表達(dá)情況。
　　(1)人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1低表達(dá)CARMA3蛋白及mRNA。
　　(2)膀胱癌細(xì)胞系5637和T24高表達(dá)CARMA3蛋白和mRNA。
　　3、應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染5637和T24后的沉默效率。

8、r>　　轉(zhuǎn)染siRNA48小時(shí)后，5637和T24細(xì)胞CARMA3蛋白及mRNA水平明顯低于陰性對(duì)照組。
　　4、轉(zhuǎn)染CARMA3后對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力的影響。
　　(1)沉默CARMA3的5637和T24細(xì)胞的增殖能力明顯低于轉(zhuǎn)染對(duì)照組。
　　(2)沉默CARMA3的5637和T24細(xì)胞的克隆形成能力明顯低于對(duì)照組。
　　5、沉默CARMA3后膀胱癌細(xì)胞中IκB蛋白的表達(dá)變化，CyclinD1和

9、Bcl-2蛋白及mRNA的表達(dá)變化。
　　(1)沉默CARMA3明顯降低了p-IκB蛋白的表達(dá)，總IκB蛋白無明顯變化。
　　(2)沉默CARMA3明顯降低了CyclinD1及Bcl-2蛋白及mRNA的水平。
　　6、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)沉默CARMA3后NF-κB的活性改變。沉默CARMA3降低了NF-κB的活性
　　結(jié)論
　　CARMA3通過激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。CARMA3