人-猴免疫缺陷病毒p27蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)與猴免疫缺陷病毒(Simianimmunodeficiencyvirus，SIV)同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，兩者的親緣關(guān)系很近。SHIV，即SIV/HIV嵌合病毒，是利用基因重組技術(shù)將SIV和HIV的相應(yīng)基因進(jìn)行置換而構(gòu)建出來(lái)的重組嵌合病毒。目前，SHIV/恒河猴動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于AIDS的研究當(dāng)中。衣殼蛋白p27是SHIV的主要抗原成分之一，也是制備抗p

2、27單克隆抗體必需的免疫原，應(yīng)用十分廣泛。本文旨在利用基因工程的方法獲得高純度的p27抗原，制備抗p27單克隆抗體，用于探索構(gòu)建檢測(cè)p27抗原的診斷試劑盒。 根據(jù)GenBank發(fā)表的人/猴免疫缺陷病毒SHIV89.6P全基因組序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物(含有EcoRI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn))，利用PCR技術(shù)從質(zhì)粒SHIV89.6P中擴(kuò)增p27gag基因，并克隆入pMD18-T載體，測(cè)序鑒定；將p27gag基因插入表達(dá)載體pET32aT

3、7啟動(dòng)子下游，構(gòu)成重組質(zhì)粒pET32a-p27并使其在大腸桿菌BL21中高效表達(dá)。利用SDS-PAGE電泳觀察外源基因表達(dá)條帶大小是否與預(yù)期相符。利用固定化金屬離子(Ni2+)配體親和層析技術(shù)從表達(dá)蛋白中純化目的蛋白，WesternBlot檢測(cè)。 將純化后的p27抗原免疫Balb/c小鼠。取免疫鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，用PEG融合。經(jīng)HAT、HT選擇培養(yǎng)后，通過(guò)有限稀釋法篩選出能產(chǎn)生p27抗體的雜交瘤細(xì)胞株。最后將擴(kuò)大培

4、養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞注入Balb/c小鼠腹腔，每只注射5×106個(gè)細(xì)胞使其產(chǎn)生腹水,制備單克隆抗體。 本試驗(yàn)主要結(jié)果如下： 1.將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，獲得與預(yù)期結(jié)果一致的大小為763bp的p27基因。 2.對(duì)重組質(zhì)粒T-p27與pET32a-p27分別進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定：雙酶切結(jié)果正確，DNA序列分析結(jié)果表明p27基因片段未發(fā)生堿基突變或缺失，證明重組質(zhì)粒已成功構(gòu)建。 3.重組質(zhì)粒pET32a-p27轉(zhuǎn)化

5、大腸桿菌BL21，將IPTG小量誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，與空白對(duì)照pET-32a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后經(jīng)IPTG小量誘導(dǎo)的產(chǎn)物相對(duì)照，在分子量43Ku和66.2Ku之間可見(jiàn)一個(gè)明顯的蛋白條帶。與預(yù)期結(jié)果46Ku的p27抗原大小一致，表明重組質(zhì)?？梢哉_表達(dá)目的蛋白。對(duì)超聲波破碎后離心所得的沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。證實(shí)目的蛋白多以可溶形式存在。 4.經(jīng)Ni2+親和層析純化后，證實(shí)目的蛋白的純度可達(dá)90

6、％以上，表明已獲得純度較高的目的蛋白。 5.以純化后的目韻蛋白作為抗原進(jìn)行單克隆單體制備，獲得5株單抗，分別命名為1A5、1C7、3C2、2D12、3D12。應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)(IFA)和蛋白免疫印跡技術(shù)(WesternBlot)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明所獲得的單克隆抗體均具有良好的特異性。 本研究成功的制備了5株能穩(wěn)定分泌抗p27蛋白特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，試驗(yàn)結(jié)果表明5株單抗均可進(jìn)行體外病毒抗原的檢測(cè)且結(jié)果良好，為進(jìn)一