禽白血病病毒p27抗原的單克隆抗體制備及雙抗體夾心ELISA檢測方法建立.pdf

1、禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)和禽肉瘤病病毒(ASV)群中的病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。存在于雞上的ALV主要為A、B、C、D、E和J等亞群，其中A、B、J亞群為臨床常見的外源性病毒，可造成各種腫瘤性死亡或生產(chǎn)性能的下降。ALV既可垂直傳播，又能水平傳播，種群凈化是防止病毒持續(xù)存在的有效方法。p27是ALV基因組中g(shù)ag基因編碼的群特異性抗原，是病毒核心衣殼蛋白的主要成分。本研究制備了針對p27抗原的單克隆抗體，并建立一種雙

2、抗體夾心ELISA檢測方法，為禽白血病的凈化工作提供一種簡便方法。
　　 本研究首先設(shè)計了一對針對p27基因的特異性引物，采用PCR方法擴增出本室分離保存的JS-9-09-Ch株ALV的p27基因并進行測序，上傳序列至GenBank獲得登錄號為：JF911742。與ALV-J HPRS-103毒株(登錄號：Z46390)p27基因序列比對，同源性為94.8％。對PCR產(chǎn)物進行純化，然后克隆到pET-32a(+)和pGEX-6P-

3、1載體，分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)和BL21菌株進行培養(yǎng)。挑選轉(zhuǎn)化成功的陽性質(zhì)粒菌株，用IPTG進行誘導(dǎo)表達，收獲菌液進行超聲波裂解，將沉淀和上清分開處理后作SDS-PAGE鑒定，在兩種菌液上清中分別出現(xiàn)目的條帶的表達，His-p27蛋白為43 kDa，GST-p27蛋白為53 kDa。用High-Affinity Ni-IDA Resin和High-Affinity GST Resin對目的蛋白His-p27和GST-p27分別進行

4、純化。
　　 將純化后的GST-p27蛋白用弗氏完全佐劑乳化后免疫8周齡BALB/c小鼠，間隔兩周加強免疫一次(第二、三次免疫用弗氏不完全佐劑)。第三次免疫后兩星期用等量抗原(不加佐劑)加強免疫一次，三天后取小鼠脾細胞與骨髓細胞瘤細胞SP2/0融合。用純化的His-p27蛋白包被ELISA反應(yīng)板，對融合成功的雜交瘤細胞進行篩選。選取陽性孔進行亞克隆，共獲得穩(wěn)定分泌抗p27抗原的單抗雜交瘤細胞系5株，分別命名為3G6、4A11、4

5、C7、4C9、7F4。以每只BALB/c小鼠腹腔注射50萬個雜交瘤細胞的數(shù)量制備腹水。3G6、4A11效價為1:102400，4C7、4C9、7F4效價為1:204800。單抗3G6、4A11、4C7、4C9亞類為IgG1，7F4為IgG2b。5株單抗均具有良好的群特異性，僅與ALV-A、ALV-B、ALV-J反應(yīng)，與感染雞的NDV、IBV、REV無交叉反應(yīng)。Western-blot和IFA試驗結(jié)果表明，所獲單抗針對ALV核衣殼蛋白p2

6、7抗原。
　　 采用競爭ELISA方法篩選出針對p27不同抗原表位的單抗7F4和4C7，分別采用Protein G和Protein A親和層析方法進行純化。應(yīng)用方陣試驗確定包被單抗7F4的最佳工作濃度為1μg/mL(1:1000稀釋)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記單抗4C7(4C7-HRP)的最佳工作濃度為0.5μg/mL(1:200稀釋)。建立的ELISA方法與ALV-A、ALV-B、ALV-J反應(yīng)，與NDV、IBV、REV無