猴免疫缺陷病毒p27基因的克隆、表達、單克隆抗體制備及鑒定.pdf

1、研究目的:人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)與猴免疫缺陷病毒(Simianimmunodeficiencyvirus,SIV)具有親緣關(guān)系,均屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬。SIV/恒河猴動物模型被廣泛應(yīng)用于AIDS的研究中。HIVp24蛋白是核衣殼蛋白,也是病毒的主要抗原成分,常用于病毒的定性定量檢測。對應(yīng)在SIV的p27蛋白,也常用于動物或體外細胞中檢測SIV的感染。本文旨在利用基因工程的方法獲

2、得高純度的p27抗原,制備抗p27單克隆抗體,用于檢測細胞和組織中SIV感染情況。
　　研究方法:從SIVmac251基因組提取RNA,以隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA。PCR按照常規(guī)方法進行。根據(jù)GenBank中猴免疫缺陷病毒SIV全基因組序列的p27蛋白的基因序列(M19499.1)合成引物:正向引物5’-GGATCCATGCCGAGAACATTAAATGGG-3’,反向引物5’-GTCGACTGCCATTAATCTAG

3、CCTTCTG-3’?；厥誔CR產(chǎn)物,克隆至pMD18-T載體,篩選陽性克隆送測序。提取pMD18-p27和pET-23a質(zhì)粒分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段,將目的基因和載體連接,構(gòu)建pET-p27質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,菌落PCR鑒定陽性克隆,抽提質(zhì)粒DNA,用BamHI和SalI雙酶切進一步鑒定并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS。接種含重組表達質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)plysS于培養(yǎng)

4、基中培養(yǎng)誘導(dǎo),分析目的蛋白的表達狀況。利用親和層析技術(shù)純化目的蛋白,免疫印跡檢測其活性。用純化后的p27蛋白免疫小鼠。獲取其脾細胞,在PEG作用下與骨髓瘤細胞SP2/0融合。經(jīng)過選擇性培養(yǎng)后,篩選產(chǎn)生p27單抗的雜交瘤細胞株,間接ELISA法測定McAb的效價。利用免疫組化技術(shù)、流式細胞術(shù)分別檢測經(jīng)SIVmac251感染后CEM×174細胞內(nèi)的病毒抗原。
　　研究結(jié)果:成功表達并純化了p27蛋白。獲得6株穩(wěn)定分泌抗SIVp27單克