大腸桿菌內(nèi)源性非編碼RNA DsrA對(duì)秀麗線蟲基因的調(diào)控作用.pdf

1、目的:
　　通過觀察表達(dá)DsrA的大腸桿菌對(duì)秀麗線蟲壽命的影響,來研究大腸桿菌內(nèi)源性非編碼RNA對(duì)秀麗線蟲基因的調(diào)控作用,進(jìn)一步探討非編碼RNA的調(diào)控途徑以及其在物種之間的作用。
　　方法:
　　用野生型大腸桿菌K12和DsrA突變的大腸桿菌(NM6003或DDS719)分別培養(yǎng)秀麗線蟲,通過壽命實(shí)驗(yàn)觀察11種秀麗線蟲(N2,dcr-1,rde-1,rde-2,rde-4,alg-1,alg-2,rrf-3,eri-3

2、,tm3026,tm2908)的壽命。利用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Polymerase Chain Reaction)和實(shí)時(shí)定量PCR觀察DsrA RNA對(duì)秀麗線蟲mRNA水平的影響,進(jìn)一步觀察RNA干擾(RNA interference,RNAi)相關(guān)基因?qū)srA RNA這種調(diào)控作用的影響。給予轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲注射DsrA RNA后使用共聚焦顯微鏡觀察F42G9.6::GFP的熒光表達(dá)變化。還通過秀麗線蟲與大腸桿菌相互作用的長期實(shí)驗(yàn)探究D

3、srA在大腸桿菌和秀麗線蟲之間的作用。
　　結(jié)果:
　　1.以DsrA缺失突變的大腸桿菌(NM6003或DDS719)為食的秀麗線蟲N2壽命長于用野生型大腸桿菌K12喂食者(P<0.01)。
　　2.F42G9.6突變的秀麗線蟲(tm2908)在兩種不同的食物野生型大腸桿菌K12和DsrA缺失突變的大腸桿菌上生長時(shí),秀麗線蟲的壽命無差異;在同樣的大腸桿菌K12上的生存時(shí)間,秀麗線蟲tm2908短于秀麗線蟲N2(P<0.

4、05)。
　　3.用大腸桿菌K12和DsrA突變的大腸桿菌分別培養(yǎng)秀麗線蟲N2,逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果均顯示大腸桿菌K12培養(yǎng)的秀麗線蟲F42G9.6 mRNA水平比DsrA突變的大腸桿菌喂食的秀麗線蟲mRNA水平低(P<0.01)。
　　4.用DsrA RNA注射轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲Pdpy-30::F42G9.6::gfp,共聚焦顯微成像顯示F42G9.6::GFP的熒光強(qiáng)度變?nèi)?熒光強(qiáng)度定量分析結(jié)果顯示熒光強(qiáng)度相對(duì)

5、降低(P<0.05);而注射轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲PF42G9.6::gfp熒光強(qiáng)度未見明顯變化。
　　5.RNAi相關(guān)基因突變的秀麗線蟲壽命實(shí)驗(yàn)顯示,大腸桿菌K12和NM6003對(duì)突變線蟲rde-4壽命影響差異不如二者對(duì)野生型秀麗線蟲N2差異明顯(P<0.05),其它七種突變線蟲(dcr-1,rde-1,rde-2,alg-1,alg-2,rrf-3,eri-3)在兩種細(xì)菌之間的壽命差異顯著(P<0.01),其中rde-2突變的線蟲在以

6、上兩種細(xì)菌上的生存時(shí)間都較秀麗線蟲N2長。
　　6.分別用大腸桿菌K12或DsrA突變的大腸桿菌NM6003培養(yǎng)秀麗線蟲rde-4和rde-2,實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:與秀麗線蟲N2相比,細(xì)菌NM6003喂食的突變線蟲rde-4的F42G9.6 mRNA水平只有很少的升高(P<0.05),而另一種秀麗線蟲rde-2則有顯著的升高(P<0.01)。
　　7.秀麗線蟲與大腸桿菌相互作用的長期實(shí)驗(yàn)結(jié)果:2周后用細(xì)菌NM6003培養(yǎng)

7、的秀麗線蟲總數(shù)比細(xì)菌K12培養(yǎng)的線蟲數(shù)目多(P<0.05);培養(yǎng)線蟲的平板上殘余的細(xì)菌K12與NM6003之間的比值較沒有線蟲的對(duì)照平板上細(xì)菌比值增加(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.表達(dá)DsrA RNA的大腸桿菌可以縮短秀麗線蟲的壽命。
　　2.大腸桿菌表達(dá)的非編碼RNA DsrA降低了秀麗線蟲的F42G9.6 mRNA的表達(dá)水平。
　　3.大腸桿菌表達(dá)的DsrA抑制秀麗線蟲基因F42G9.6的表達(dá)可能并