禽病原性大腸桿菌與尿道致病性大腸桿菌相關鐵攝取系統(tǒng)與調控蛋白RfaH及莢膜致病作用的研究.pdf

1、大腸桿菌是寄居在哺乳動物和禽類腸道中正常菌群之一，這一物種由非致病性菌株和具有不同致病潛能的致病菌株組成。少數(shù)致病性菌株，可引起機體腸道感染和腸道外感染兩大類疾病。致腸道外感染的大腸桿菌，如尿道致病性大腸桿菌(Uropathogenic E.coli，UPEC)，新生兒腦膜炎大腸桿菌(Neonatal meningitis-associated E.coli，NMEC)和敗血癥大腸桿菌(Sepsis-causing E.coli，SEP

2、EC)已被Johnson和Russo歸為一種新型致病性大腸桿菌—腸道外致病性大腸桿菌（Extraintestinal pathogenic E.coli，ExPEC）。另外，引起家禽局部或全身性感染的禽病原性大腸桿菌(Avian pathogenic E.coli，APEC)與引起人類感染的ExPEC(NMEC和UPEC)具有某些相似的致病因子，如1型菌毛、P菌毛、莢膜、鐵攝取系統(tǒng)、侵襲素IbeA等。有假設認為禽可能是UPEC的主要攜帶

3、者，或者APEC可能是UPEC毒力基因的貯庫。
　　本研究主要通過探討莢膜、鐵攝取系統(tǒng)、轉錄調控蛋白RfaH對APEC和UPEC致病性的影響，比較兩者毒力因子和致病機理的相似性，從而加深我們對APEC、UPEC毒力基因的形成、演化、致病機制的理解，強化我們對APEC作為UPEC毒力基因貯庫這一推斷的認識，為深入研究尿道感染（Urinary tract infections，UTIs）和禽大腸桿菌病的致病機理和特異防制措施奠定基礎。

4、
　　1.鐵攝取系統(tǒng)對腸道外致病性大腸桿菌毒力的影響
　　APEC和UPEC都含有多種鐵攝取系統(tǒng)，包括血紅素和鐵結合性復合物。本研究以血紅素、沙門菌素和氣桿菌素三種鐵攝取系統(tǒng)為研究對象，分別選取其攝鐵相關基因chuT、iroD、iucD，運用λRed重組系統(tǒng)構建APEC E058和UPEC U17基因缺失株，進行了多項體外及體內試驗，評價其致病性，旨在探究鐵攝取系統(tǒng)與APEC和UPEC致病性之間的關系，并比較兩者毒力因子之間

5、的相似性，為深入研究APEC和UPEC的致病機理和特異性防制措施奠定基礎。研究結果顯示，在SPF雞感染模型中，沙門菌素缺失株E058△iroD和U17△iroD與野生株相比，致病力顯著下降，氣桿菌素缺失株E058△iucD和U17△iucD在部分臟器中定植能力下降，而血紅素缺失株E058△chuT和U17△chuT未見致弱。三基因缺失株E058△chuT△iroD△iucD和U17△chuT△iroD△iucD致弱程度最為顯著。組織病理

6、學結果顯示，野生株感染雞的臟器病變程度較△iroD，△iucD及三基因缺失株感染情況更為嚴重，而△chuT缺失株感染雞的臟器病變程度與野生株相似。但是，體外試驗結果顯示，突變株與野生株在抗血清補體殺菌、HD-11細胞吞噬和胞內增殖，及在富鐵或缺鐵培養(yǎng)基中生長情況等方面都沒有顯著差異。SPF雞致病試驗表明介導沙門菌素攝鐵的iroD基因和編碼氣桿菌素合成的iucD基因與APEC和UPEC致病性有較強的相關性，而介導血紅素攝鐵基因chuT對其

7、致病性影響不大。APEC和UPEC具有相似的攝鐵機制和致病能力，同時還可以看出沙門菌素鐵結合性復合物在雞體內攝鐵方面起著更為重要的作用，但這些攝鐵系統(tǒng)之間的關系是相互獨立還是存在依賴關系還不清楚，有待于進一步研究。
　　2.調控蛋白RfaH調控相關基因表達情況及對腸道外致病性大腸桿菌毒力的影響
　　RfaH在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中是一種重要的調控蛋白，能夠增強某些細菌相關毒力因子的表達，如莢膜、脂多糖、溶血素、鐵攝取系統(tǒng)

8、等。它對于APEC毒力的直接影響至今還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)rfaH基因的缺失能顯著降低APEC E058和UPEC U17的致病力。1日齡雛雞致病性試驗結果顯示rfaH基因突變株E058△rfaH和U17△rfaH對雞失去致病力，35日齡SPF雞體內動態(tài)分布和競爭試驗顯示△rfaH突變株在雞體內定殖能力顯著下降;血清殺菌學試驗表明突變株抗血清補體殺菌能力顯著下降;雞巨噬細胞HD-11吞噬和細菌胞內定殖試驗結果顯示，突變株抗吞噬和胞內生存

9、能力明顯致弱。對突變株進行rfaH基因回復能夠使其恢復到野生株的毒力水平。同時，熒光定量PCR試驗結果顯示rfaH基因缺失能顯著降低莢膜轉運相關基因kpsM和kpsE、血紅素受體基因chuA、抗血清補體相關基因traT和iss，及腸菌素ColicinV合成基因cvaC的表達量。上述結果表明，RfaH是腸道外致病性大腸桿菌的一種重要的毒力因子，對其致病性起著關鍵的作用。
　　3.腸道外致病性大腸桿菌莢膜缺失株的構建及其致病性研究

10、r>　　莢膜在大腸桿菌抗血清補體和細胞吞噬方面發(fā)揮著重要的作用，利用λRed重組系統(tǒng)分別構建APEC E058和UPEC U17莢膜轉運基因kpsED雙基因缺失株E058△kpsED和U17△kpsED，并成功將抗性基因去除，研究其生物學特性，為弱毒疫苗的開發(fā)提供條件。生物學試驗結果顯示，kpsED雙基因缺失株的生長速度較野生株沒有明顯差異，但缺失株抗血清補體殺菌能力和抗雞巨噬細胞HD-11細胞吞噬能力顯著下降。kpsED雙基因的缺失能