ERK通路調(diào)控正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)牙周膜干細胞內(nèi)皮向分化的機制研究.pdf

1、牙周炎作為常見的口腔慢性炎癥性疾病，常導(dǎo)致牙周支持組織破壞，進而造成牙齒脫落，并可以影響一些全身性疾病的發(fā)病和病程。但是至今對于牙周炎發(fā)病及病程發(fā)展的機制尚不完全明確。牙周炎在發(fā)病過程中，炎性組織可以產(chǎn)生血管生成因子和炎性細胞因子，促進細胞內(nèi)皮向分化，最終形成大量新生血管?，F(xiàn)已證實牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）具有向內(nèi)皮細胞分化并形成血管的能力，但是對于調(diào)控其分化的胞內(nèi)機制尚

2、不完全明確。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路是調(diào)節(jié)細胞活動的關(guān)鍵通路之一，在真核細胞內(nèi)廣泛存在，影響著細胞分裂增殖、分化、自噬、凋亡等多種生理病理行為。ERK1/2是ERK通路的關(guān)鍵蛋白，ERK1/2的磷酸化和去磷酸化是將分子信號從細胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)的關(guān)鍵步驟。當細胞受到細胞外基質(zhì)的生長因子刺激后， ERK1/2通過一系列酶反應(yīng)被激活，從而對細胞的活動進行調(diào)

3、節(jié)。
　　牙周膜干細胞在不同局部微環(huán)境下的多向分化能力是否發(fā)生變化、如何變化、受到什么因素或信號的調(diào)節(jié)、對生物學(xué)功能有何影響等已經(jīng)有一些研究報道，但主要集中于成骨分化方向；對其他方向分化可能及影響程度等尚少有研究。
　　本課題針對于此，使用TNF-α模擬炎癥微環(huán)境，觀察ERK通路的活化對正常及炎癥微環(huán)境下PDLSCs內(nèi)皮向分化的調(diào)控作用；為進一步深入探討不同分化方向能力變化和選擇性調(diào)控奠定實驗基礎(chǔ)。
　　1.研究目的：

4、
　　探討正常及炎癥微環(huán)境下，ERK通路在PDLSCs內(nèi)皮向分化中的作用，為PDLSCs分化調(diào)控應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　1.1.體外培養(yǎng)和鑒定人牙周膜干細胞（hPDLSCs）。使用血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）聯(lián)合誘導(dǎo)PDLSCs內(nèi)皮向分化，檢測誘導(dǎo)后細胞內(nèi)

5、皮向分化相關(guān)的相關(guān)指標水平，建立PDLSCs內(nèi)皮向分化模型。在體外使用炎性因子TNF-α模擬體內(nèi)炎癥微環(huán)境對PDLSCs進行刺激，并檢測內(nèi)皮向分化相關(guān)指標，建立炎癥微環(huán)境內(nèi)皮向分化模型。
　　1.2.按所建立正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)皮向分化模型，對PDLSCs進行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)，檢測誘導(dǎo)后細胞增殖情況和內(nèi)皮向分化相關(guān)指標水平。比較兩種不同誘導(dǎo)環(huán)境對PDLSCs增殖和內(nèi)皮向分化的影響。
　　1.3.按照模型誘導(dǎo)PDLSCs分化，觀察

6、細胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平隨不同時間點和誘導(dǎo)方法而發(fā)生的改變。
　　1.4.阻斷ERK1/2磷酸化過程后，在正常及炎癥微環(huán)境對PDLSCs進行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)，檢測誘導(dǎo)后細胞增殖情況和分化相關(guān)指標水平。比較阻斷前后細胞分化能力的改變，明確ERK通路對PDLSCs內(nèi)皮向分化的作用。
　　2.研究方法：
　　2.1.采用酶消化法獲取原代牙周膜細胞，單細胞克隆純化細胞?？寺⌒纬蓪嶒灆z測細胞增殖能力，流式細胞術(shù)檢測細胞表面表達

7、間充質(zhì)干細胞標志物的陽性率，成骨及成脂誘導(dǎo)定性檢測細胞多向分化能力。
　　2.2.對兩種誘導(dǎo)環(huán)境下的PDLSCs進行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)， Real-time PCR檢測PDLSCs誘導(dǎo)后內(nèi)皮相關(guān)基因CD31、VEGF及VE-cadherin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。流式細胞術(shù)檢測誘導(dǎo)后細胞中CD31+和VE-cadherin+細胞比例。MatrigelTM基質(zhì)膠內(nèi)進行細胞管腔形成實驗，并拍照統(tǒng)計管腔形成數(shù)目、分支節(jié)點數(shù)及管腔長度。根據(jù)這些

8、指標比較正常及炎癥微環(huán)境PDLSCs內(nèi)皮向分化能力的差異。
　　2.3.使用U0126作為ERK1/2磷酸化阻斷劑，溶劑DMSO作為陰性對照。提取PDLSCs誘導(dǎo)后0h、1h、3h、6h、12h的蛋白，Western blotting檢測ERK1/2磷酸化水平。正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)誘導(dǎo)以及加入U0126后分化誘導(dǎo)1h，提取蛋白檢測ERK1/2磷酸化水平。
　　2.4.加入U0126阻斷ERK1/2磷酸化過程，正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)

9、對PDLSCs進行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)，DMSO作為陰性對照，Real-time PCR檢測誘導(dǎo)后PDLSCs內(nèi)皮相關(guān)基因CD31、VEGF及VE-cadherin mRNA轉(zhuǎn)錄水平；流式細胞術(shù)檢測誘導(dǎo)后細胞中CD31+和VE-cadherin+細胞比例；MatrigelTM基質(zhì)膠內(nèi)進行細胞管腔形成實驗，并拍照統(tǒng)計管腔形成數(shù)目、分支節(jié)點數(shù)及管腔長度并進行比較。比較阻斷ERK1/2磷酸化過程對PDLSCs在兩種條件下內(nèi)皮向分化能力的差異。

10、>　　3.研究結(jié)果：
　　3.1.原代培養(yǎng)純化后細胞呈長梭形，呈放射狀排列，長軸之間近于平行。鑒定細胞發(fā)現(xiàn)細胞具有克隆形成能力；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示純化所得細胞高表達間充質(zhì)干細胞標志物，低表達造血干細胞標志物；成骨及成脂誘導(dǎo)實驗顯示細胞具有成骨和成脂分化潛能。
　　3.2.PDLSCs內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)后檢測內(nèi)皮向分化指標，Real-time PCR和流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，對于炎癥微環(huán)境中誘導(dǎo)分化的PDLSCs，VE-cadheri

11、n和VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平、CD31+和VE-cadherin+細胞比例顯著高于正常環(huán)境培養(yǎng)條件下，管腔形成能力也明顯高于正常環(huán)境培養(yǎng)條件下內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)的PDLSCs。
　　3.3.Western blotting顯示PDLSCs經(jīng)過內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)，ERK1/2磷酸化水平升高，其中1h和3h顯著高于誘導(dǎo)前。選取誘導(dǎo)后1h這一時間點，分別在正常及炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)和加入U0126后進行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境中誘導(dǎo)的p-ER

12、K1/2水平高于正常條件下，而U0126可以阻斷誘導(dǎo)引起的ERK1/2的磷酸化過程。
　　3.4.Real-time PCR和流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，加入U0126后，PDLSCs的內(nèi)皮細胞相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達水平以及管腔形成能力均明顯降低，表明阻斷了ERK1/2磷酸化過程會抑制PDLSCs的內(nèi)皮向分化過程。但炎癥微環(huán)境中阻斷ERK1/2磷酸化對內(nèi)皮向分化過程的抑制并不完全。
　　結(jié)論：
　　PDLSCs被VEG