糖基化終末產(chǎn)物介導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞增殖及骨向分化過(guò)程中的Wnt經(jīng)典信號(hào)通路研究.pdf

1、目的：糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)與糖尿病多種并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)，近年來(lái)，許多研究表明晚期AGEs的積聚參與了促進(jìn)糖尿病和牙周炎的發(fā)生、發(fā)展。而牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)具有自我更新和多向分化潛能，在維持牙周結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用，其功能數(shù)量的變化會(huì)導(dǎo)致牙周膜的破壞。AGEs是否通過(guò)影響牙周膜干細(xì)胞的增殖及分化，來(lái)促進(jìn)牙周炎的發(fā)展進(jìn)程呢?同時(shí)，AGEs是通過(guò)什么信號(hào)途徑影響牙周膜干細(xì)胞的增殖及分化呢?迄今均不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究A

2、GEs介導(dǎo)的牙周膜干細(xì)胞在增殖及骨向分化過(guò)程中的改變及其中Wnt經(jīng)典通路中主要相關(guān)因子的變化與PDLSCs增殖和分化改變的相關(guān)性。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)主要采用體外組織塊法培養(yǎng)正常的牙周膜細(xì)胞，通過(guò)有限稀釋法克隆化培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀進(jìn)行干細(xì)胞表型分子鑒定，得到正常的PDLSCs。以兩組細(xì)胞(健康組N-PDLSCs組和AGEs刺激組A-PDLSCs組)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象：①計(jì)算其克隆形成率；②MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；③實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(r

3、eal time PCR、RT-PCR)檢測(cè)Wnt經(jīng)典通路中DKK-1(Wnt通路的抑制劑)、β-catenin；④Western Blot檢測(cè)細(xì)胞核蛋白中β-catenin的表達(dá)。以及對(duì)兩組細(xì)胞加入成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)7天進(jìn)行ALP染色；誘導(dǎo)21天茜素紅染色觀察鈣化結(jié)節(jié)的形成情況；RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)7天后的成骨基因ALP、BSP、RUNX-2的表達(dá)及Wnt經(jīng)典通路中β-catenin、DKK-1的表達(dá)；Western Blo

4、t檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證加入成骨誘導(dǎo)后的成骨蛋白表達(dá)和細(xì)胞核中蛋白β-catenin的表達(dá)；N-PDLSCs組成骨誘導(dǎo)過(guò)程中加入Wnt通路激活劑LICL，檢測(cè)其中相關(guān)的成骨能力；最后在A-PDLSCs組成骨誘導(dǎo)過(guò)程中加入Wnt通路激活劑LICL及抑制劑DKK-1檢測(cè)成骨基因ALP、BSP、RUNX-2的表達(dá)狀況。
　　 結(jié)果：1.牙周膜干細(xì)胞分離純化及初步鑒定：有限稀釋法篩選的PDLSCs形態(tài)間無(wú)明顯差異，均呈長(zhǎng)梭形，胞體豐滿。經(jīng)過(guò)流式

5、細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD146、STRO-1、CD105、CD29等表型分子，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為：38.8％、16.8％、95.0％、99.7％，從而明確了該干細(xì)胞的特性。
　　 2.克隆形成率及MTT比較：與N-PDLSCs組相比，A-PDLSCs組的克隆形成率較低，兩組細(xì)胞的克隆形成率分別為25.3±1.6％、17.2±2.1％，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MTT法連續(xù)七天對(duì)兩組細(xì)胞增殖情況顯示，與N-PDLS

6、Cs組相比，A-PDLSCs的細(xì)胞增殖明顯減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.成骨誘導(dǎo)后成骨能力的比較：成骨誘導(dǎo)兩組細(xì)胞7天后，ALP染色在A-PDLSCs組明顯淺于N-PDLSCs組，誘導(dǎo)21天茜素紅染色結(jié)果顯示A-PDLSCs組誘導(dǎo)后鈣化結(jié)節(jié)少于N-PDLSCs組；另外，誘導(dǎo)7天后RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A-PDLSCs組成骨基因BSP、ALP、Runx-2的表達(dá)都較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)We

7、stern Blot的結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果相一致。
　　 4.增殖和骨向分化過(guò)程中Wnt經(jīng)典通路中相關(guān)因子的比較：在增殖過(guò)程中對(duì)Wnt經(jīng)典通路基因β-catenin、DKK-1進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，β-catenin在A-PDLSCs組表達(dá)低于N-PDLSCs組，而DKK-1在A-PDLSCs組表達(dá)明顯高于N-PDLSCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Weston Blot結(jié)果也顯示A-PDLSCs組核蛋白中的β-c

8、atenin表達(dá)明顯低于N-PDLSCs組，這與RT-PCR結(jié)果相符；成骨誘導(dǎo)一周后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：總的β-catenin在A-PDLSCs組表達(dá)高于N-PDLSCs組，DKK-1在A-PDLSCs組表達(dá)明顯低于N-PDLSCs組，并且Weston Blot顯示核蛋白β-catenin的表達(dá)在A-PDLSCs組高于N-PDLSCs組。
　　 5.正常細(xì)胞成骨誘導(dǎo)過(guò)程中加入Wnt通路激活劑LICL、抑制劑DKK-1后成

9、骨基因表達(dá)的變化：N-PDLSCs組加入LICL刺激后成骨基因BSP、ALP、Runx-2表達(dá)都有不同程度的下調(diào)。A-PDLSCs組在LICL刺激后成骨基因的表達(dá)都比未加LICL刺激組表達(dá)低，而在加抑制劑的DKK-1組，其成骨能力與單獨(dú)的N-PDLSCs組相比，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在AGEs的作用下：PDLSCs增殖過(guò)程中Wnt經(jīng)典通路被抑制，其增殖能力下調(diào)；而在PDLSCs骨向分化階段，Wnt經(jīng)典通路