利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)植酸酶中二硫鍵功能的研究.pdf

1、在飼料中添加植酸酶可提高植物性飼料中磷的利用率和單胃動(dòng)物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收率，并減輕動(dòng)物排泄物中磷對(duì)環(huán)境的污染。在生產(chǎn)酶制劑的過(guò)程中提高植酸酶基因的表達(dá)水平以及改善植酸酶的穩(wěn)定性是亟待解決的問(wèn)題。隨著基因工程的發(fā)展，在分子水平上對(duì)酶基因進(jìn)行改造為改良酶蛋白開辟了一條新的途徑。二硫鍵是蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈間唯一的共價(jià)鍵，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及功能具有重要的作用。植酸酶PHYA中共含有五對(duì)二硫鍵(Cys12-Cys21，Cys52-Cys395，C

2、ys196-Cys446，Cys245-Cys263，Cys417-Cys425)，通過(guò)研究植酸酶分子中二硫鍵對(duì)酶的催化活性及穩(wěn)定性的影響，找出影響穩(wěn)定性的關(guān)鍵部位，可以為通過(guò)引入二硫鍵來(lái)提高酶的穩(wěn)定性打下基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證明二硫鍵對(duì)植酸酶的空間結(jié)構(gòu)和催化活性有重要作用，并利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)其中的3對(duì)二硫鍵進(jìn)行了單突變?nèi)笔а芯?，初步結(jié)果表明其中兩對(duì)對(duì)植酸酶的熱穩(wěn)定性有重要作用。為全面確定5對(duì)二硫鍵的作用，在已有的3個(gè)

3、單突變體的基礎(chǔ)上，又構(gòu)建了另外6個(gè)突變體(包括4個(gè)單突變體和2個(gè)雙突變體)，結(jié)合前期得到的3個(gè)單突變體，研究5對(duì)二硫鍵的缺失對(duì)植酸酶的結(jié)構(gòu)和功能的影響，得到的主要結(jié)果如下： 1.對(duì)植酸酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的研究表明：二硫鍵Cys12-Cys21和Cys196-Cys446的缺失明顯降低了植酸酶對(duì)底物的親和力、催化效率和底物專一性，同時(shí)酶的最適pH也有所改變。二硫鍵Cys12-Cys21、Cys52-Cys395、Cys196-

4、Cys446的缺失使植酸酶反應(yīng)最適溫度(反應(yīng)時(shí)間10分鐘)由50℃分別變?yōu)?5℃、55℃、40℃。 2.利用內(nèi)源熒光光譜技術(shù)對(duì)野生型和突變體植酸酶的空間構(gòu)象進(jìn)行了研究，結(jié)果表明5對(duì)二硫鍵的缺失使植酸酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了或多或少的改變，其中二硫鍵Cys52-Cys395的缺失使植酸酶空間結(jié)構(gòu)變得尤為松散。 3.對(duì)野生型和突變體植酸酶熱穩(wěn)定性分析表明，二硫鍵Cys52-Cys395、Cys245-Cys263、Cys417