二硫鍵氧化還原酶DsbA-DsbC協(xié)助瑞替普酶包涵體體外復性研究.pdf

1、富含二硫鍵重組蛋白在大腸桿菌中表達時由于二硫鍵的錯配極易形成包涵體，其體外重折疊復性問題一直是生物下游過程的瓶頸，研究新型重組蛋白復性策略，發(fā)展適合于大規(guī)模生產(chǎn)此類蛋白的高效復性方法具有重要實際意義。本文以瑞替普酶(reteplase)為研究對象，將二硫鍵氧化還原酶DsbA/DsbC引入復性體系以促進二硫鍵的正確形成，圍繞reteplase包涵體制備及DsbA/DsbC協(xié)助復性開展研究。
　　首先，成功構建了reteplase的E

2、.coli表達載體，制備得到了reteplase包涵體。細胞破碎后，每升發(fā)酵液可分離得到粗制包涵體1.7g。經(jīng)洗滌純化和溶解后，reteplase變性液的純度可達85％以上。隨后，采用稀釋復性法對變性reteplase進行了簡單復性研究，在對低蛋白濃度下reteplase復性條件進行單因素考察的基礎上，運用正交試驗設計對高蛋白濃度(800μg/mL)下的reteplase體外復性過程進行了優(yōu)化，其活性收率呈現(xiàn)明顯的提高。
　　其次

3、，發(fā)酵制備得到了重組DsbA與DsbC蛋白，采用Ni-NTA親和層析進行了純化，DsbA/DsbC蛋白產(chǎn)量分別為166 mg DsbA/L發(fā)酵液與78 mg DsbC/L發(fā)酵液，且純度分別可達到98％和95％。將純化后的DsbA/DsbC固定化于NHS-activatedSepharose4 Fast Flow凝膠上，穩(wěn)定性測試表明其固定化后穩(wěn)定性能良好，且固定化率高。研究了不同固定化DsbA/DsbC添加量、氧化還原環(huán)境、復性溫度、p

4、H、尿素濃度等因素對固定化DsbA/DsbC協(xié)助reteplase復性效果的影響。結果顯示，相較于固定化DsbA，DsbC能更有效協(xié)助reteplase包涵體的復性，復性后活性收率可達65.8％，比稀釋復性提高了40.3％。
　　最后，結合固定化DsbC與SEC層析技術構建了復合層析柱，詳細研究了固定化DsbC協(xié)助reteplase柱上復性效果。考察了SEC柱體積、洗脫流速、上樣方式等參數(shù)對復性過程的影響，優(yōu)化后活性收率提高到81