二硫鍵氧化還原酶DsbA-DsbC協(xié)助瑞替普酶包涵體體外復(fù)性研究.pdf

1、富含二硫鍵重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)由于二硫鍵的錯(cuò)配極易形成包涵體，其體外重折疊復(fù)性問(wèn)題一直是生物下游過(guò)程的瓶頸，研究新型重組蛋白復(fù)性策略，發(fā)展適合于大規(guī)模生產(chǎn)此類蛋白的高效復(fù)性方法具有重要實(shí)際意義。本文以瑞替普酶(reteplase)為研究對(duì)象，將二硫鍵氧化還原酶DsbA/DsbC引入復(fù)性體系以促進(jìn)二硫鍵的正確形成，圍繞reteplase包涵體制備及DsbA/DsbC協(xié)助復(fù)性開(kāi)展研究。
　　首先，成功構(gòu)建了reteplase的E

2、.coli表達(dá)載體，制備得到了reteplase包涵體。細(xì)胞破碎后，每升發(fā)酵液可分離得到粗制包涵體1.7g。經(jīng)洗滌純化和溶解后，reteplase變性液的純度可達(dá)85％以上。隨后，采用稀釋復(fù)性法對(duì)變性reteplase進(jìn)行了簡(jiǎn)單復(fù)性研究，在對(duì)低蛋白濃度下reteplase復(fù)性條件進(jìn)行單因素考察的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)高蛋白濃度(800μg/mL)下的reteplase體外復(fù)性過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化，其活性收率呈現(xiàn)明顯的提高。
　　其次

3、，發(fā)酵制備得到了重組DsbA與DsbC蛋白，采用Ni-NTA親和層析進(jìn)行了純化，DsbA/DsbC蛋白產(chǎn)量分別為166 mg DsbA/L發(fā)酵液與78 mg DsbC/L發(fā)酵液，且純度分別可達(dá)到98％和95％。將純化后的DsbA/DsbC固定化于NHS-activatedSepharose4 Fast Flow凝膠上，穩(wěn)定性測(cè)試表明其固定化后穩(wěn)定性能良好，且固定化率高。研究了不同固定化DsbA/DsbC添加量、氧化還原環(huán)境、復(fù)性溫度、p

4、H、尿素濃度等因素對(duì)固定化DsbA/DsbC協(xié)助reteplase復(fù)性效果的影響。結(jié)果顯示，相較于固定化DsbA，DsbC能更有效協(xié)助reteplase包涵體的復(fù)性，復(fù)性后活性收率可達(dá)65.8％，比稀釋復(fù)性提高了40.3％。
　　最后，結(jié)合固定化DsbC與SEC層析技術(shù)構(gòu)建了復(fù)合層析柱，詳細(xì)研究了固定化DsbC協(xié)助reteplase柱上復(fù)性效果?？疾炝薙EC柱體積、洗脫流速、上樣方式等參數(shù)對(duì)復(fù)性過(guò)程的影響，優(yōu)化后活性收率提高到81