二硫鍵對胰島素聚集性的影響.pdf

1、研究背景:蛋白可以發(fā)生聚集而形成淀粉樣纖維。蛋白的聚集和一些疾病的發(fā)生有關(guān),如阿爾茲海默病和帕金森病。蛋白的聚集與一系列因素有關(guān),包括二硫鍵。一般認(rèn)為,在維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及折疊的過程中,二硫鍵起重要作用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?胰島素分子由兩條多肽鏈組成,含有三對二硫鍵(兩對鏈間二硫鍵A7-B7、A20-B19及一對鏈內(nèi)二硫鍵A6-A11)。本研究中,我們以胰島素作為模式蛋白,研究逐個二硫鍵對胰島素聚集的影響。實(shí)驗(yàn)方法:使用三(2-羧乙基)膦(

2、TCEP)作為還原劑來分別還原豬胰島素(PI)三對二硫鍵中的兩對二硫鍵,并將還原的到的巰基用碘乙酰胺進(jìn)行烷基化。獲得三種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的胰島素類似物:INS-2(缺失A6-A11),INS-3(缺失A7-B7),INS-6(同時缺失A6-A11和A7-B7)。遠(yuǎn)紫外-圓二色光譜的結(jié)果顯示:在中性pH下,INS-2的結(jié)構(gòu)與PI的結(jié)構(gòu)最接近,其次是INS-3和INS-6;在酸性pH下,三種異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)大都呈無規(guī)則卷曲狀態(tài)。我們還用硫磺素T(T

3、hT)熒光法和電子顯微鏡(TEM)檢測了二硫鍵缺失的PI異構(gòu)體的聚集性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:結(jié)果顯示,三種異構(gòu)體的聚集性相對于胰島素都有所增加,其聚集性從高到低依次為:INS-6>INS-3>INS-2。光交聯(lián)法顯示,二硫鍵A6-A11缺失的胰島素類似物(INS-2和INS-6)比A6-A11完好的類似物(INS-3)更容易形成寡聚體,從而對人的紅細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的破壞作用。結(jié)論:二硫鍵A7-B7的缺失更容易導(dǎo)致PI結(jié)構(gòu)的變化,增加聚集性;二硫鍵A6