基于定點(diǎn)突變技術(shù)的家蠶酪氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH, EC1.14.16.2)是一種以四氫生物喋呤和亞鐵離子為輔因子，L-酪氨酸為底物，催化氧化L-酪氨酸形成多巴的芳香族氨基酸羥化酶。該反應(yīng)是兒茶酚胺類及其衍生物生物合成的第一步也是整個(gè)過程中的限速步驟。L-多巴是機(jī)體合成多巴胺、黑素及腎上腺素等生物活性物質(zhì)的前體物質(zhì)，多巴在一系列酶的作用下轉(zhuǎn)化為兒茶酚類及其衍生物，并且參與到鞣化與免疫黑化中。酪氨酸羥化酶廣泛存在于人類、哺乳

2、動(dòng)物和昆蟲中，是新陳代謝不可缺少的酶類。因此研究酪氨酸羥化酶的結(jié)構(gòu)、功能及其穩(wěn)定性具有十分重要的意義。本研究以家蠶性腺為材料，克隆家蠶（Bombyx mori）酪氨酸羥化酶基因（BmTH）的開放閱讀框架，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21（DE3），表達(dá)重組蛋白并經(jīng)親和層析純化。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步分析了家蠶酪氨酸羥化酶的基本酶學(xué)性質(zhì)、酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)、底物結(jié)合能力、點(diǎn)突變對(duì)其功能、結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性的變化。本實(shí)驗(yàn)的研

3、究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.家蠶酪氨酸羥化酶（BmTH）基因的克隆、誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定：利用RT-PCR和 PCR技術(shù)將 BmTH編碼區(qū)克隆到表達(dá)載體 pET28a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（DE3）進(jìn)行IPTG和溫度誘導(dǎo)表達(dá)分析，結(jié)果表明1mM IPTG誘導(dǎo)在16℃菌體表達(dá)活性蛋白量最大。跑SDS-PAGE以及Western-blot分析表明獲得的酶蛋白大小約為63.4kD。為進(jìn)一步研究BmTH體外酶學(xué)性質(zhì)及相關(guān)功能等方面的研

4、究打下基礎(chǔ)。
　　2.重組家蠶酪氨酸羥化酶的酶學(xué)性質(zhì)：利用酶標(biāo)儀分析測定了分離純化得到的酪氨酸羥化酶酶活性及其動(dòng)力學(xué)參數(shù)。這些參數(shù)包括 KmTyr、KmBH4、Kcat和Vmax分別為26.3±4.8μmol／L、51.9±5.5μmol／L、4.7 S-1和4.7±0.6μmol.min-1，我們也得到酶最適PH在6.8和最適溫度28~37℃。
　　3.家蠶酪氨酸羥化酶重要氨基酸分析：利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得酪氨酸羥化酶的突變

5、型用于研究它們與底物酪氨酸、四氫生物蝶呤和亞鐵離子之間的結(jié)合能力及其對(duì)酶活性影響。突變型 BmTH-H394Q和 BmTH-E434A對(duì)于亞鐵離子的激活作用降低，突變型BmTH-Y429E、BmTH-AA-和BmTH-E434A的KmBH4顯著升高，突變型 BmTH-AA-的 KmTyr顯著升高，然而其他突變型都未發(fā)生明顯變化。說明His394和Glu434是亞鐵離子相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)，Tyr429和Glu434是四氫生物蝶呤相關(guān)的氨基酸

6、位點(diǎn)，酪氨酸羥化酶N-末端調(diào)節(jié)區(qū)對(duì)酶結(jié)構(gòu)和活性都有很大影響。
　　4.酪氨酸羥化酶的重要氨基酸突變對(duì)其活性、空間結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的影響：突變型BmTH-H394Q、BmTH-Y429E、BmTH-E434A和BmTH-AA-的酶活性都顯著的降低，而突變型BmTH-D419G的酶活性無明顯變化。His394、Tyr429、Glu434和N-AA-的突變和缺失引起了酶的空間結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致酶活性降低和疏水區(qū)的更多暴露，突變后它們結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性