蛋白二硫鍵異構(gòu)酶和淀粉合成酶基因沉默對(duì)水稻耐熱及結(jié)實(shí)特性的影響.pdf

1、高溫脅迫是制約水稻產(chǎn)量潛力發(fā)揮和品質(zhì)穩(wěn)定的主要逆境因素之一，它對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)形成的影響作用，與水稻“庫(kù)”、“源”器官中的碳、氮代謝過(guò)程存在著密切聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究工作表明，蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因(PDI)、可溶性淀粉合成酶的SSSⅠ和SSSⅢa基因，不僅是水稻“庫(kù)”器官中的貯藏蛋白積累和淀粉合成途徑的重要調(diào)控基因，而且對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)也表現(xiàn)較敏感，可能是高溫脅迫對(duì)稻米品質(zhì)形成及其優(yōu)劣產(chǎn)生影響的幾個(gè)重要功能基因位點(diǎn)。為此，本文構(gòu)建了

2、淀粉合成酶SSSⅠ和SSSⅢa基因的RNAi沉默載體，以及PDI基因的RNAi沉默和超表達(dá)載體，并通過(guò)轉(zhuǎn)化日本晴的愈傷組織，獲得其轉(zhuǎn)基因水稻植株，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合水稻在不同生育時(shí)期的高溫脅迫試驗(yàn)，對(duì)上述基因沉默或超表達(dá)后的有關(guān)生理生態(tài)特征及相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了研究分析。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.以野生日本晴的發(fā)育籽粒為材料，通過(guò)PCR法克隆了PDI基因保守區(qū)450bp大小的靶標(biāo)序列作為干擾區(qū)段，構(gòu)建了含有內(nèi)含子hpRNA

3、(ihpRNA)的雙元表達(dá)載體pTCK303-RiOsPDI，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化日本晴，獲得8株轉(zhuǎn)基因植株;通過(guò)在T0代對(duì)其潮霉素(Hyg)抗性基因的PCR鑒定及Southern雜交檢測(cè)，確證攜帶有干擾片段的T-DNA區(qū)已整合到水稻基因組中，且在轉(zhuǎn)基因T1代符合3∶1的分離模式;半定量RT-PCR和熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果表明，PDI基因沉默轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株不同器官中的PDI表達(dá)量均顯著降低，尤其是其籽粒中的PDI表達(dá)量較微，幾乎能引起靶基

4、因80％左右的沉默;對(duì)轉(zhuǎn)基因T2代植株的高溫結(jié)實(shí)特性和籽粒理化品質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果表明，PDI基因沉默會(huì)引起水稻的耐熱性顯著下降，在高溫脅迫處理下的結(jié)實(shí)率大幅度降低，但其在常溫處理下的結(jié)實(shí)率與對(duì)照之間無(wú)顯著差異。此外，PDI基因沉默后，稻米的透明度下降、堊白度有所增加，但對(duì)籽粒粗蛋白總量和直鏈淀粉含量的影響不甚明顯。
　　 2.以PCR法從日本晴發(fā)育胚乳中克隆了水稻PDI基因編碼區(qū)(coding sequence region,CDS

5、)，目標(biāo)片段為1631bp，包含了PDI基因的全表達(dá)序列，構(gòu)建了Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的超表達(dá)載體pTCK303-OsPDI，并轉(zhuǎn)化日本晴成熟胚的愈傷組織，獲得有9株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，T1代半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PDI基因沉默后，其幼苗器官中的PDI表達(dá)量顯著低于其野生對(duì)照植株，而PDI基因的超表達(dá)則存在相反效果，表現(xiàn)出其抑制或促進(jìn)PDI基因表達(dá)的效果;水稻苗期的高溫生態(tài)試驗(yàn)結(jié)果揭示，PDI基因在高溫脅迫下呈上調(diào)表達(dá)，但持

6、續(xù)高溫脅迫會(huì)引起PDI基因表達(dá)量的下降，但Bip基因在高溫脅迫前期的表達(dá)量較低，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其相對(duì)表達(dá)量大幅升高，與PDI基因呈“此消彼長(zhǎng)”的變化趨勢(shì)，兩者可能在水稻抵御高溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中起“互補(bǔ)”作用。
　　 3.利用PCR法分別克隆了水稻淀粉合成酶基因SSSⅠ和SSSⅢa保守區(qū)399bp和389bp大小的靶標(biāo)序列作為干擾區(qū)段，分別構(gòu)建了含有內(nèi)含子hpRNA(ihpRNA)的雙元表達(dá)載體pTCK303-RiOsSSSⅠ

7、和pTCK303-RiOsSSSⅢa，轉(zhuǎn)化日本晴后，分別獲得了12株和13株SSSⅠ和SSSⅢa基因沉默的陽(yáng)性植株。半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，SSSⅠ和SSSⅢa基因沉默后， T1代轉(zhuǎn)基因植株苗期葉片中的SSSⅠ或SSSⅢa基因在常溫下表達(dá)量均顯著低于其對(duì)照植株，分別都起到了較明顯的干擾效果，而其他同工型基因（如SSSⅡb、SSSⅢb、SSSⅣa、SSSⅣb）的表達(dá)水平并未受明顯影響;在高溫脅迫下，SSSⅠ基因RNAi沉默植株可溶