二甲雙胍對雌鼠性早熟伴胰島素抵抗與脂肪芳香化酶作用的研究.pdf

1、目的：
　　1.建立性早熟伴胰島素抵抗雌鼠模型，測定雌二醇水平及其脂肪組織中芳香化酶表達、mRNA轉(zhuǎn)錄水平，應用二甲雙胍進行藥物干預后測定雌激素水平及脂肪組織芳香化酶表達變化，并與對照組進行比較。探討二甲雙胍在改善糖代謝、脂代謝及胰島素抵抗的同時，對雌激素水平及脂肪組織芳香化酶表達的影響，為臨床應用二甲雙胍治療胰島素抵抗的同時改善女童性早熟提供更多理論依據(jù)。
　　2.應用細胞培養(yǎng)技術(shù)建立3T3-L1胰島素抵抗脂肪細胞模型，以

2、不同濃度二甲雙胍進行實驗干預，并以丙酸睪酮作為催化反應底物，觀察脂肪細胞在胰島素抵抗情況下芳香化酶表達及其活性，同時觀察二甲雙胍干預對芳香化酶表達的影響是否與MEK/ERK信號通路有關，并進一步討論其干預的分子水平機制。
　　方法：
　　1.正常斷乳（21天）SD雌性幼鼠45只，隨機分為普通飲食組（NC組10只）和高脂飲食組（FC組35只），每日觀察雌鼠陰門開啟情況并記錄陰門開啟日齡。對比 NC組陰門開啟日齡，將 FC組分為

3、陰門早開組即性早熟組（FC-P組），對其進行稱重、取血測雌二醇及空腹胰島素水平，行OGTT并測定各時間點血糖，結(jié)果顯示存在胰島素抵抗，證明性早熟伴胰島素抵抗雌鼠造模成功，并將其隨機分為模型組（IR組）、低劑量治療組（IR-L組）和高劑量治療組（IR-H組）。治療組分別給予不同劑量二甲雙胍（Metformin, Met）灌胃治療6周。測量給藥前后大鼠的體重，并在實驗結(jié)束時取血檢測各組大鼠的空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、雌二醇

4、（E2）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL），計算穩(wěn)態(tài)模型胰島抵抗指數(shù)（HOMA-IR）；處死各組大鼠并取腎周及卵巢周圍脂肪進行稱重，計算脂體比；應用蛋白免疫印跡法（western blot）及實時熒光定量（RT-PCR）檢測脂肪組織中芳香化酶的表達及其mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　2.應用細胞培養(yǎng)技術(shù)對3T3-L1前脂肪細胞進行培養(yǎng)以及誘導分化。參考相關文獻對前脂肪細胞的分化方法，對細胞

5、進行誘導分化：將培養(yǎng)狀態(tài)良好的3T3-L1前脂肪細胞接種于培養(yǎng)皿，加入含地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）的培養(yǎng)液進行逐步誘導分化，至第9天90％以上的細胞呈成熟脂肪細胞表型，可用于后續(xù)試驗。細胞內(nèi)可見明顯脂滴，采用油紅 O染色法進行成熟脂肪細胞鑒定。胰島素抵抗脂肪細胞模型的建立：對已經(jīng)誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞進行分組處理，采用高糖/高胰島素處理脂肪細胞，測定培養(yǎng)液上清中葡萄糖含量并計算其消耗量，以葡萄糖

6、消耗量及消耗率反映脂肪細胞胰島素抵抗程度。在成功建立胰島素抵抗脂肪細胞模型基礎上，觀察細胞中芳香化酶表達、基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，以及不同濃度二甲雙胍對其影響：設空白對照組、胰島素抵抗模型組、不同濃度二甲雙胍干預組（10-5、10-4、10-3mol/L）。藥物處理48h后應用western blot及RT-PCR方法檢測各組脂肪細胞中芳香化酶的表達及其mRNA轉(zhuǎn)錄水平；同時應用酶聯(lián)免疫方法，以丙酸睪酮為底物，測定各組培養(yǎng)液中雌二醇濃度，以

7、了解各組細胞中芳香化酶催化活性。在胰島素抵抗脂肪細胞模型+10-3mol/L二甲雙胍組中加入MEK抑制劑（PD98059），觀察加入PD98059后芳香化酶表達、mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.高脂飼料喂養(yǎng)的雌鼠可出現(xiàn)性早熟、肥胖，表現(xiàn)為陰門開啟時間提前、體重及體內(nèi)雌激素水平升高（P<0.05）；并同時伴有胰島素抵抗。二甲雙胍可降低胰島素抵抗雌鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量及脂體比（P<0.05）。二甲雙胍在調(diào)節(jié)糖、脂代謝

8、的同時改善胰島素抵抗、降低雌鼠體內(nèi)雌激素水平（P<0.05）；且二甲雙胍呈劑量依賴性下調(diào)糖代謝指標及雌激素水平。性早熟伴胰島素抵抗雌鼠脂肪組織芳香化酶表達及基因轉(zhuǎn)錄水平均較正常飲食雌鼠升高，二甲雙胍呈劑量依賴性下調(diào)性早熟伴胰島素抵抗雌鼠脂肪組織芳香化酶表達及其基因轉(zhuǎn)錄水平（P<0.05）。
　　2.采用高糖/高胰島素培養(yǎng)方法，可將誘導分化成熟的3T3-L1脂肪細胞建立為胰島素抵抗脂肪細胞模型。胰島素抵抗脂肪細胞中芳香化酶表達量升高

9、，二甲雙胍呈劑量依賴性下調(diào)胰島素抵抗脂肪細胞中芳香化酶的表達及雌激素的產(chǎn)生（P<0.05）。加入 MEK抑制劑后，二甲雙胍下調(diào)胰島素抵抗脂肪細胞芳香化酶的作用減弱。
　　結(jié)論：
　　1.高脂飼料喂養(yǎng)的雌鼠可出現(xiàn)性早熟、肥胖及胰島素抵抗。
　　2.二甲雙胍在調(diào)節(jié)性早熟伴胰島素抵抗雌鼠糖、脂代謝的同時，改善其胰島素抵抗。
　　3.胰島素抵抗狀態(tài)下雌二醇水平升高，脂肪組織及脂肪細胞芳香化酶表達水平升高。
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