豬血凝血酶、免疫球蛋白等5種蛋白質(zhì)和血紅素的分離提取.pdf

1、豬血富含多種生物活性成分，是寶貴的生物資源，蘊(yùn)藏著巨大的開發(fā)潛力和利用價值。本論文以提高豬血的綜合利用價值為目的，對豬血漿中纖維蛋白原、凝血酶、白蛋白、免疫球蛋白的連續(xù)分離工藝以及對豬血紅細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)和血紅素的同步分離工藝進(jìn)行了研究，主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下： 1．豬血的抗凝處理、紅細(xì)胞和血漿的分離條件。收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的新鮮豬血，用3.8％的檸檬酸鈉溶液與血液按體積比1：9混合抗凝；抗凝血在轉(zhuǎn)速4000 r/min下

2、，離心10min，收集血漿和紅細(xì)胞分別進(jìn)行處理。 2．研究了血漿中纖維蛋白原、凝血酶、免疫球蛋白、白蛋白的提取方法和條件。利用血漿中纖維蛋白原的冷沉淀性質(zhì)，先對血漿進(jìn)行凍融處理，分離纖維蛋白原(凝血酶的作用底物)，再選用專一吸附劑檸檬酸鋇吸附凝血酶原，最后以鹽析法分離免疫球蛋白和白蛋白。優(yōu)化后條件如下： (1)抗凝血槳在-20℃下冷凍12h，4℃下解凍，2500r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，收集沉淀和上清液。沉淀的主

3、要成分為纖維蛋白原，經(jīng)檢測樣品中纖維蛋白原含量82.6％，纖維蛋白原提取率為91.0％。 (2)上述上清液中按體積比加入血漿體積8％1mol/L的氯化鋇，離心收集上清(提取白蛋白和免疫球蛋白)和沉淀。沉淀用0.2mol/L pH8.0：EDTA解析得凝血酶原。凝血酶原中加入2mol/LCaCl<,2>，使Ca<'2+>終濃度為0.1mol/L，25℃下激活2h。經(jīng)離子交換純化后，凝血酶的比活達(dá)到604.4U/mg，回收率為74

4、.3％，純化倍數(shù)為15.7。再經(jīng)Sephadex G-75進(jìn)一步純化，用0.05mol/L，、pn7.2的Tris-HCl緩沖液上樣、洗脫，得到凝血酶電泳單點(diǎn)純，比活為1072.8U/mg，回收率為69.7％，純化倍數(shù)為27.9。 (3)在上清液中加入終濃度為50％飽和硫酸銨，調(diào)節(jié)溶液pH值為7.2，4℃下靜置2h,在4℃、10000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，上清液經(jīng)透析，濃縮得白蛋白粗品。沉淀主要含有免疫球蛋白。檢測白

5、蛋白的量為31.41g/L血漿，樣品中白蛋白純度為93.1％，白蛋白提取率為90.5％。免疫球蛋白的量為13.86g/L血漿，樣品中免疫球蛋白純度約為80.3％，提取率為91.8％。 3．對紅細(xì)胞中SOD和血紅素的同步提取工藝進(jìn)行了研究。工藝參數(shù)如下： (1)紅細(xì)胞的超聲波破碎條件為：加入紅細(xì)胞體積1/5的去離子水，超聲波功率200W，破碎時間為15min，得到紅細(xì)胞溶解液。 (2)SOD提取條件為：在紅細(xì)

6、胞溶解液中加入0.25倍的預(yù)冷乙醇和0.15倍預(yù)冷氯仿，使血紅蛋白變性沉淀。上清中加入2倍體積的冷丙酮沉淀SOD，把沉淀溶于磷酸緩沖液后，再經(jīng)Cu<'2+>熱變性等操作提取SOD。所得SOD粗品比活為1650.9U/mg，回收率為83.3％。 (3)血紅素提取條件：向血紅蛋白沉淀中加入紅細(xì)胞體積5倍的丙酮，調(diào)其pH值為2.2。此條件下血紅素溶于酸性丙酮中，而珠蛋白沉淀，收集提取液；利用鞣酸法從提取液中沉淀血紅素。利用本工藝每L