豬血G型免疫球蛋白的分離提取研究.pdf

1、免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是對(duì)抗原刺激應(yīng)答中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性的結(jié)合，產(chǎn)生各種免疫效應(yīng)(生理效應(yīng))的一類(lèi)球蛋白。大量研究報(bào)道了口服免疫球蛋白可以有效地預(yù)防和治療嬰幼兒由大腸桿菌和輪狀病毒引發(fā)的腸道疾病。豬血中免疫球蛋白含量很高，其中以G型免疫球蛋白(ImmunoglobulinG，簡(jiǎn)稱(chēng)IgG)為主。我國(guó)豬血資源十分豐富，但并未得到很好地利用，為了實(shí)現(xiàn)豬血的“變廢為寶”，大力開(kāi)發(fā)免疫球蛋白資源，對(duì)豬

2、血中IgG的開(kāi)發(fā)應(yīng)用進(jìn)行了深入研究，為其在保健食品和飼料中的應(yīng)用提供了工藝路線(xiàn)和科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為其它血液功能性蛋白資源的應(yīng)用提供可借鑒的思路和方法。 通過(guò)改進(jìn)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法測(cè)定樣品中IgG和其它血清蛋白的含量，從而掌握分離提取工藝對(duì)IgG純度和回收率的影響；利用直接酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定樣品中活性IgG的含量，從而了解不同工藝參數(shù)對(duì)免疫球蛋白活性的影響。根據(jù)所得IgG純度、回收率和活性保留率數(shù)據(jù)，選擇合適的提取方法

3、和工藝參數(shù)。 建立了實(shí)驗(yàn)室分離純化豬血清IgG的方法。利用硫酸銨進(jìn)行初分：室溫下，樣品pH為7.4，硫酸銨飽和度為37％，此時(shí)IgG回收率為80.5％(w/w)，純度為72.9％(w/w)；用DEAE-纖維素52作進(jìn)一步純化，可以得到純度大于97％(w/w)、活性保留率為94％(w/w)的豬血清IgG。 分別研究了多聚磷酸鹽和三氯化鐵分離提取豬血清IgG的工藝。多聚磷酸鹽沉淀法分離豬血清IgG的最佳工藝參數(shù)為：多聚磷酸鹽

4、濃度0.1％(w/v)，pH值3.9，反應(yīng)溫度45℃，此條件下IgG的回收率與純度分別為60.9％(w/w)和64.5％(w/w)，活性保留率為87.3％(w/w)。FeCl3分離豬血清IgG最佳工藝參數(shù)為：FeCl3濃度4.5mmol/L，溫度40℃，pH值4.5，此條件下IgG的純度為71.7％(w/w)，回收率為75.5％(w/w)，活性保留率約為90.5％(w/w)。所得到的產(chǎn)品中蛋白質(zhì)主要為IgG，其余部分大多為γ球蛋白。通過(guò)

5、比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)eCl3分離豬血清IgG的工藝操作簡(jiǎn)便，過(guò)程溫和，分離效果好，安全可靠，具有很高的實(shí)用性，適宜食品用IgG的工業(yè)化生產(chǎn)。 選擇螺旋卷式超濾設(shè)備，以截留液全循環(huán)錯(cuò)流方式對(duì)FeCl3分離所得IgG樣液進(jìn)行超濾濃縮，超濾膜為截留分子量10,000DA的PES膜。超濾濃縮的最佳工藝條件為：樣品pH值為7，溫度50℃，超濾壓力0.1Mpa，濃度提高10倍。濃縮后得到的樣品中蛋白質(zhì)含量為2.08％(w/v)，IgG含量為1.42

6、％(w/v)，具有活性的IgG所占比例比超濾前略有下降，從91.3％(w/w)降低到87.6％(w/w)。 根據(jù)所采用的豬血清IgG分離制備工藝，研究了低pH環(huán)境和加熱對(duì)IgG活性的影響，結(jié)果顯示：pH低于4以后IgG穩(wěn)定性下降，部分IgG變性，其結(jié)構(gòu)和構(gòu)象發(fā)生改變。IgG熱變性的溫度范圍為70.265～72.162℃吸熱量為338.4J/g。pH為7時(shí)，IgG在55℃時(shí)開(kāi)始有輕微變性，其變性速度隨著溫度的升高逐漸加快。酸性條件

7、下較低溫度就會(huì)造成IgG變性。因此，從豬血清中分離提取IgG時(shí)，樣品的pH值不應(yīng)小于3.5，反應(yīng)溫度不宜高于50℃。 乳蛋白、寡糖、糖醇、氨基酸對(duì)IgG均有熱保護(hù)作用。將20％(w/v)的脫脂乳粉、0.5％(w/v)的甘氨酸和5％(w/v)的麥芽糖混合后作為熱保護(hù)劑添加到超濾濃縮得到的料液中可以有效地減少?lài)婌F干燥時(shí)IgG的活性損失。以海藻糖為保護(hù)劑可以減少I(mǎi)gG冷凍干燥時(shí)的活性損失。干燥方式和是否添加保護(hù)劑決定了產(chǎn)品中IgG的含