BTBD7調(diào)控Slug誘導唾液腺腺樣囊性癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關研究.pdf

1、目的:
　　唾液腺腺樣囊性癌(Salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是一種罕見的惡性腫瘤，僅占所有頭頸部腫瘤的1％。其特點是較高的局部侵犯及遠處轉(zhuǎn)移，易轉(zhuǎn)移至肺、肝和骨骼。遠處轉(zhuǎn)移患者存活率低于未轉(zhuǎn)移者。目前，對于唾液腺腺樣囊性癌的治療尚無有效的解決方案，治療手段仍是以手術聯(lián)合放療或者化療的綜合治療為主，長期的生存率偏低，治療效果不佳。由于缺乏具有特異性的腫瘤標志物，SACC治療存在局限。隨

2、著對唾液腺腺樣囊性癌生物學行為和分子機制研究的不斷深入，能否找到更具有特異性的腫瘤標記物對診斷和治療唾液腺腺樣囊性癌有重大的意義。
　　上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是一個重要的生理病理過程，它導致大多數(shù)惡性腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)移過程中上皮細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞。Slug是EMT的轉(zhuǎn)錄因子，具有鋅指結構，在EMT進程、癌細胞的入侵和轉(zhuǎn)移、維持干細胞的特征中發(fā)揮重要作用。SACC腫瘤組織中，Slug蛋白表達升高且在其侵犯神經(jīng)過程中Slug

3、沉默可下調(diào)EMMPRIN，上調(diào)E-鈣粘蛋白的表達，抑制EMT。
　　BTB域是在真核生物中存在的蛋白質(zhì)相互作用的基序。BTB/POZ結構域蛋白7(BTBD7)含有保守的BTB/POZ蛋白交互作用基序，包含明顯的轉(zhuǎn)錄因子的結合位點，包括甲胎蛋白(AFP)1，CAAT增強子結合蛋β，GATA，激活蛋白等。近年來，BTBD7被認為是促進上皮組織重組和分支結構器官形成的調(diào)控因子。局部BTBD7高表達會引起Slug、E-鈣粘蛋白的局部改變以

4、及提高上皮細胞能動性。此外，BTBD7參與肺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程和肝細胞癌中的EMT。然而，BTBD7在唾液腺腺樣囊性癌(SACC)中的作用研究未見報道。
　　本研究通過免疫組織化學的方法，檢測BTBD7和Slug在SACC組織中的表達情況，分析BTBD7的表達與臨床病理參數(shù)以及患者預后的關系，分析其表達在SACC中的意義;通過基因沉默技術，進一步研究BTBD7沉默對高侵襲性SACC-LM腫瘤細胞體外侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖能力等生物學行為的影

5、響，采用qRT-PCR技術和Western blot技術檢測BTBD7沉默后Slug以及EMT相關基因的表達，探討B(tài)TBD7在SACC中的生物學機制，為SACC的診斷和治療提供新的靶點。
　　方法:
　　1、收集因病損手術切除的66例唾液腺腺樣囊性癌患者的組織蠟塊和15例正常的唾液腺組織蠟塊，免疫組織化學法檢測BTBD7及Slug蛋白在SACC組織和正常唾液腺組織中的表達，統(tǒng)計學分析檢驗BTBD7與Slug在SACC中表達的

6、相關性以及與患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、組織類型，遠處轉(zhuǎn)移的相關性。
　　2、Kaplan-Meier生存分析法分析BTBD7陽性與BTBD7陰性患者生存率的差異。COX多元比例風險分析探尋影響SACC患者生存的影響因素。
　　3、細胞免疫熒光檢測BTBD7及Slug在SACC-LM細胞及SACC-83細胞中的表達情況。
　　4、利用小干擾RNA技術沉默SACC-LM細胞中BTBD7基因的表達，qRT-PC

7、R技術和Western blot技術檢測BTBD7、Slug以及EMT相關基因的mRNA和蛋白表達的變化。
　　5、細胞劃痕試驗檢測BTBD7基因沉默后SACC-LM細胞的遷移能力，Transwell侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力，MTT實驗檢測細胞的增殖能力。
　　結果:
　　1.在唾液腺腺樣囊性癌組織中，BTBD7和Slug多為高表達，而在正常唾液腺組織中多為不表達或者低表達。BTBD7和Slug表達增高與SACC的T

8、NM分級，組織類型、遠處轉(zhuǎn)移相關，與患者的年齡、性別、腫瘤的大小無關。在唾液腺腺樣囊性癌組織中，BTBD7與Slug的陽性表達呈顯著正相關，在Slug陽性表達的組織中，BTBD7陽性表達率為70.2％(33/47)。
　　2.根據(jù)66位患有唾液腺腺樣囊性癌的患者術后隨訪結果，Kaplan-Meier生存曲線表明，BTBD7陽性表達的患者總體存活率顯著低于BTBD7陰性表達的患者。COX多元比例風險分析表明BTBD7陽性表達、Slu

9、g陽性表達和腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移是患者預后的獨立風險因素。BTBD7陽性表達的患者的生存風險是陰性表達患者的3.287倍。
　　3.免疫熒光染色顯示，BTBD7和Slug在SACC-LM和SACC-83細胞系中呈陽性表達。BTBD7陽性表達主要是位于兩種細胞的胞質(zhì)，Slug在兩種細胞的胞質(zhì)和胞核中均有表達。
　　4.qRT-PCR技術和Western bolt技術檢測發(fā)現(xiàn)，BTBD7基因沉默后，SACC-LM細胞中，BTBD7、S

10、lug、MMP9的mRNA及蛋白的表達顯著升高，相反，E-鈣粘連蛋白的mRNA及蛋白的表達明顯降低。
　　5.沉默BTBD7基因，明顯抑制SACC-LM細胞的遷移、侵襲能力，細胞的增殖能力未見明顯的影響。
　　結論:
　　在唾液腺腺樣囊性癌組織中，BTBD7陽性表達的患者生存率較低，預后差，預示其在SACC的發(fā)展進程中發(fā)揮著重要的作用。在唾液腺腺樣囊性癌細胞系SACC-LM中，BTBD7基因沉默后能顯著提高Slug m