唾液腺腺樣囊性癌中酸敏感離子通道的特性和功能研究.pdf

1、缺氧和組織酸化是惡性腫瘤較為常見的病理變化之一,但腫瘤細(xì)胞如何感受pH的變化,以及如何將細(xì)胞外的信號轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)信號,目前還不甚清楚.大量的研究結(jié)果提示:機(jī)體細(xì)胞可以通過對膜上蛋白的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)胞外信號和胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)換,這其中最重要的就是離子通道和膜受體蛋白.對于細(xì)胞外pH的變化,機(jī)體細(xì)胞就可以通過直接激活酸敏感離子通道(Acid-Sensing Ion Channels,ASICs)而實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)外pH的調(diào)節(jié). 唾液腺腺樣囊性癌 (sa

2、livary adenoid cystic carcinoma,SACC)是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一,好發(fā)于腮腺、頜下腺、舌下腺及小唾液腺.它具有很強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移性,極易侵襲神經(jīng)并循神經(jīng)擴(kuò)散,致使切除范圍不足時,術(shù)后易復(fù)發(fā),而盲目擴(kuò)大切除,必然給患者帶來不必要的畸形和功能障礙;并且它容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移至肺部.因此對腺樣囊性癌細(xì)胞的這種"嗜神經(jīng)侵襲性"和"遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移"生物學(xué)特性的研究一直是國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注的問題.近來研究表明,上述現(xiàn)象可能與腫

3、瘤細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化,以及一些營養(yǎng)因子與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體的相互作用有關(guān).目前已發(fā)現(xiàn)有特異性神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物S100、GFAP等的表達(dá),但對SACC細(xì)胞膜受體蛋白的研究甚少.酸敏感離子通道(ASICs)就是神經(jīng)細(xì)胞膜上一類可以被酸性溶液直接激活的通道蛋白,有研究表明ASICs的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度和侵襲性呈正相關(guān).回顧文獻(xiàn)報道,目前國內(nèi)外尚未見報道唾液腺腺樣囊性癌中酸敏感離子通道的特性和功能研究,本研究采用電生理膜片鉗技術(shù)結(jié)合細(xì)胞化學(xué)

4、和分子生物學(xué)手段,以及藥理學(xué)方法等實驗技術(shù),通過對人腺樣囊性癌細(xì)胞系(ACC-2)及唾液腺腺樣囊性癌組織中酸敏感離子通道的特性和功能進(jìn)行初步研究,擬為藥物研發(fā)和臨床治療提供新的靶點和理論依據(jù). [研究目的]: 1.分別對正常唾液腺組織及腺樣囊性癌組織、腺樣囊性癌細(xì)胞(ACC-2)中的ASICs進(jìn)行分子鑒定,了解其主要的構(gòu)成亞基.2.研究唾液腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACC-2)中ASICs的電生理學(xué)特性.3.觀察腺樣囊性癌組織及

5、ACC-2細(xì)胞中ASICs蛋白的表達(dá)及分布情況.4.初步研究ACC-2細(xì)胞中ASICs的功能. [方法與結(jié)果]: 1.SACC中ASICs基因表達(dá)的研究 [方法]:采用RT-PCR的方法對20例SACC病例、6例正常唾液腺組織及培養(yǎng)的腺樣囊性癌細(xì)胞(ACC-2)中的ASICs mRNA水平進(jìn)行了檢測. [結(jié)果]:在腺樣囊性癌組織和ACC-2細(xì)胞中,我們分別在649bp、642bp和335bp處發(fā)現(xiàn)了ASICl a

6、、ASIC2a及ASIC3的條帶,提示在SACC組織和ACC-2細(xì)胞中ASIC1a、ASIC2a及ASIC3是其主要的構(gòu)成亞基,而在正常唾液腺組織均未見明顯的條帶形成.2.ACC-2細(xì)胞中ASICs的電生理學(xué)特性研究[方法]:應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)及藥理學(xué)方法,對ACC-2細(xì)胞上質(zhì)子激活電流的一般特性、電流.電壓關(guān)系、藥理學(xué)特性、通透性及其在高Zn<'2+>溶液中電流幅度的變化進(jìn)行研究. [結(jié)果]:酸性溶液(pH=3.0)可以濃度依賴性地

7、誘導(dǎo)ACC-2細(xì)胞產(chǎn)生一內(nèi)向穩(wěn)態(tài)電流,電流的激活閾值約pH4.5,其翻轉(zhuǎn)電位大約為+19.37mV,并且該電流可以被ASICs非特異性的阻斷劑 amiloride 所阻斷,但ASICla同聚體通道的特異性阻斷劑PcTX1對該電流則沒有影響,同時該通道的離子通透性遵循 P<,Na><'+>>P<,K><'+>>P<,Cs><'+>>P<,Ca><'2+>的規(guī)律,提示ACC-2細(xì)胞上表達(dá)有ASICs;結(jié)合細(xì)胞外使用高Zn<'2+>溶液可以增

8、強(qiáng)該電流幅度的藥理學(xué)實驗結(jié)果,提示ACC-2細(xì)胞上主要有功能的是ASIC2a.3.SACC中ASICs蛋白水平的測定[方法]:運用免疫印跡及免疫組織化學(xué)的手段,進(jìn)一步觀察腺樣囊性癌組織及ACC-2細(xì)胞中ASICs蛋白的表達(dá)及分布情況. [結(jié)果]: 運用細(xì)胞和組織化學(xué)方法,進(jìn)一步證實了在ACC-2細(xì)胞、SACC組織中的確有ASICla、ASIC2a及ASIC3的表達(dá),但在正常組織及多形性腺瘤組織中沒有表達(dá).在ACC-2細(xì)胞

9、中所觀察到的 ASICla 是一接近50kDa的蛋白條帶,而與正常表達(dá)在細(xì)胞膜上的 70kDa的 ASICla 不相符,推測在ACC-2細(xì)胞中表達(dá)的ASICla可能是一種剪接變異體;ASIC2a在ACC-2細(xì)胞中除了在細(xì)胞膜上有明顯的表達(dá),在細(xì)胞核里也有廣泛的分布,提示ASIC2a可能也存在剪接變異體,當(dāng)然也不能排除ASIC2a有被糖基化或者磷酸化的可能. 2.ACC-2細(xì)胞中ASICs功能的初步研究 [方法]:取出培養(yǎng)

10、在24孔板中的ACC-2細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,用PBS洗3次后,加入相應(yīng)的酸性溶液(pH3.0),或含1mM amiloride的pH3.0溶液(事先用lmMamiloride的pH7.4溶液處理15min)37℃處理1.5h后,再用PBS洗3次后,加入不含酚紅的DMEM(Gibco,USA)37℃恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)21-24h,并以正常培養(yǎng)液中的ACC-2細(xì)胞作對照,用LDH試劑盒(Roche MolecularBiochemicals)檢測

11、細(xì)胞釋放的LDH. [結(jié)果]: 酸性溶液對ACC-2細(xì)胞激活A(yù)SICs后,與始終處于pH7.4培養(yǎng)液的ACC-2細(xì)胞相比較,前者24h內(nèi)LDH釋放量明顯下降(P<0.05),當(dāng)使用ASICs非特異性的阻斷劑amiloride抑制ASICs的激活后,我們觀察到amiloride可以阻斷酸性溶液所誘導(dǎo)的LDH釋放量下降效應(yīng)(P<0.05).這些結(jié)果提示ACC-2細(xì)胞中ASICs的激活與細(xì)胞的生長增殖呈正相關(guān). [結(jié)論

12、]: 1.在腺樣囊性癌組織及ACC-2細(xì)胞中存在ASICl a、ASIC2a及ASIC3基因,而正常唾液腺組織中未見明顯條帶形成; 2.ACC-2細(xì)胞上表達(dá)有ASICs;結(jié)合藥理學(xué)實驗結(jié)果,提示ACC-2細(xì)胞上主要有功能的是ASIC2a; 3.在ACC-2細(xì)胞、SACC組織中有ASICl a、ASIC2a及ASIC3的表達(dá),但在正常組織及多形性腺瘤組織中未見明顯表達(dá)(P<0.05): 4.通過乳酸脫氫酶(