二氫楊梅素通過PPARγ-FGF21-AMPK信號(hào)通路改善胰島素抵抗的機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成為嚴(yán)重影響人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題之一。2型糖尿病(T2DM)是糖尿病最常見的類型，其主要特征是骨骼肌等外周胰島素作用靶組織對(duì)胰島素敏感性下降，即胰島素抵抗(insulin resistance，IR)。IR貫穿于T2DM發(fā)生、發(fā)展的全過程，同時(shí)也是導(dǎo)致糖尿病各種并發(fā)癥的“動(dòng)力”根源。臨床常用的降糖藥物如羅格列酮等噻唑烷二酮類(troglitazone，TZDs)等在改善IR的同

2、時(shí)可促進(jìn)脂肪儲(chǔ)存、水鈉潴留等，長期使用毒副作用明顯，故臨床使用受到極大限制。近年來，從天然植物化合物中篩選無毒副作用的新型降糖藥物已成為胰島素增敏劑類T2DM治療藥物的主要發(fā)展方向之一。
　　大量研究顯示，膳食來源的植物化合物具有顯著的健康保護(hù)效應(yīng)，是藥物研發(fā)很好的潛在供體。一些廣泛存在于蔬菜水果中的黃酮類化合物如木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)等已被發(fā)現(xiàn)可降低血糖，增加胰

3、島素敏感性而調(diào)節(jié)糖代謝。二氫楊梅素(dihydromyricetin，DHM)，又名蛇葡萄素(ampelopsin，AMP)是藥食兩用植物藤茶（也稱霉茶）中含量很高的一種黃酮類化合物，在嫩莖葉中含量高達(dá)20％以上（以干重計(jì)）。DHM分子結(jié)構(gòu)與槲皮素、木犀草素極為相似，已被證實(shí)具有抗氧化、解酒保肝、抗腫瘤等多種藥理功效。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道，二氫楊梅素可降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖，但其具體作用機(jī)制尚未明確。
　　過氧化物酶體增殖物激

4、活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)是Ⅱ型核激素受體超家族成員之一，與機(jī)體糖脂代謝調(diào)節(jié)密切有關(guān)。臨床常用的降糖藥物羅格列酮等噻唑烷二酮類(TZDs)就是以PPARγ為作用靶標(biāo)的胰島素增敏劑，可有效改善IR。有研究表明在脂肪細(xì)胞中，PPARγ激動(dòng)劑可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生長因子-21（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF21）的表達(dá)，從而進(jìn)一步增加P

5、PARγ的活性;而FGF21又可激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，增強(qiáng)線粒體功能和氧化能力，從而改善糖耐量。本實(shí)驗(yàn)室另一課題組研究發(fā)現(xiàn)DHM可激活A(yù)MPK促進(jìn)線粒體生成，進(jìn)而改善大鼠在急性低氧條件下的體能下降。因此推測(cè)，藤茶提取物及DHM可能通過激活PPARγ、上調(diào)FGF21的表達(dá)，活化AMPK信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)改善胰島素抵抗的作用。
　　本研究首先用高脂喂養(yǎng)SD大鼠并聯(lián)合

6、小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射(STZ，30mg/kg)建立T2DM大鼠模型。建模成功后將T2DM大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組(DIA)、二甲雙胍組(MET,125 mg/kg)、二氫楊梅素組（DHM，100mg/kg）、藤茶提取物低劑量組（R50，50 mg/kg）、中劑量組(R100，100 mg/kg)及高劑量組（R200，200 mg/kg）6組。每組大鼠分別灌胃給藥干預(yù)4周后，放射免疫分析法測(cè)定大鼠血清中胰島素、胰島素C肽;ELISA法

7、測(cè)定大鼠血清FGF21水平;western blot法檢測(cè)肌肉組織中IRS-1、Akt、FGF21、AMPK、PPARγ蛋白表達(dá);qRT-PCR法檢測(cè)肌肉組織中FGF21、PPARγ mRNA的表達(dá)，觀察藤茶提取物改善胰島素抵抗的效果;其次，以棕櫚酸(Palmitic acid，PA)誘導(dǎo)L6骨骼肌成肌細(xì)胞建立胰島素抵抗體外模型，進(jìn)一步探討DHM改善胰島素抵抗的作用及其分子機(jī)制，為糖尿病的防治尋找新的策略，同時(shí)為新型降糖藥物的研發(fā)提供實(shí)

8、驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　主要結(jié)果與結(jié)論:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:藤茶提取物及二氫楊梅素可改善糖尿病大鼠的肌纖維萎縮、變性等炎性改變。與糖尿病組相比，二甲雙胍組、二氫楊梅素組和藤茶提取物組大鼠血糖、血清胰島素水平、HOMA-IR指數(shù)、血清FGF21水平顯著降低(P＜0.05)，而胰島素C肽水平顯著升高(P＜0.05);肌肉組織中pIRS-1、pAkt、 pAMPK、FGF21、PPARγ蛋白表達(dá)上調(diào)，同時(shí)FGF21、PPARγ mRNA

9、的表達(dá)升高(P＜0.05)，提示藤茶提取物及二氫楊梅素可顯著改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的胰島素抵抗。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　(1) DHM可劑量依賴和時(shí)間依賴增強(qiáng)PA誘導(dǎo)的胰島素抵抗的L6細(xì)胞的葡萄糖攝取能力，并上調(diào)胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白pAkt、pIRS-1的表達(dá)，提示DHM可有效改善PA誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗。
　　(2) DHM劑量依賴和時(shí)間依賴的激活A(yù)MPK，AMPK特異性抑制劑Compound C和A

10、MPK siRNA明顯抑制DHM介導(dǎo)的AMPK激活，并降低DHM介導(dǎo)的胰島素抵抗的L6細(xì)胞葡萄糖攝取能力增強(qiáng)，并且pAkt、pIRS-1的表達(dá)水平升高，提示DHM改善L6骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗作用可能與其激活A(yù)MPK有關(guān)。
　　(3) DHM劑量依賴和時(shí)間依賴的上調(diào)胰島素抵抗的L6細(xì)胞FGF21的表達(dá)，F(xiàn)GF21siRNA顯著抑制DHM對(duì)AMPK的激活作用，降低DHM介導(dǎo)的胰島素抵抗的L6細(xì)胞葡萄糖攝取能力增強(qiáng)以及pIRS-1，pA

11、kt的表達(dá)的上調(diào)，提示DHM通過上調(diào)FGF21的表達(dá)激活A(yù)MPK，進(jìn)而發(fā)揮改善L6骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗的作用。
　　(4) DHM劑量依賴和時(shí)間依賴的增加PPARγ的表達(dá)，而PPARγ特異性抑制劑GW6992和PPARγ siRNA能顯著抑制DHM介導(dǎo)的FGF21表達(dá)上調(diào)和對(duì)AMPK的激活作用，抑制DHM誘導(dǎo)的pIRS-1、pAkt的表達(dá)的上調(diào)作用，進(jìn)而降低DHM增強(qiáng)胰島素抵抗的L6細(xì)胞葡萄糖攝取能力的作用，提示DHM通過激活PP