SIRT2在急性髓系白血病多藥耐藥中的作用研究.pdf

1、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是血液病中最常見的疾病。目前，藥物化療是治療AML的主要方法，大部分患者可以經(jīng)過化療后得到緩解。但是，部分患者在經(jīng)過治療后不能得到完全緩解，另外，完全緩解后的患者中仍有很大部分會復(fù)發(fā)，最終導(dǎo)致治療失敗。白血病細(xì)胞的原發(fā)耐藥及復(fù)發(fā)耐藥是治療失敗的主要原因。深入探索白血病細(xì)胞耐藥過程中的分子機制，提高白血病細(xì)胞對治療藥物的敏感性是目前研究的熱點。SIRT2是煙酰胺腺嘌呤二

2、核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide，NAD+)依賴性的第三類組蛋白去乙?；窼ir2家族成員之一，可通過去乙?；饔脜⑴c細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移、增殖等活動。研究表明SIRT2可參與調(diào)節(jié)AML細(xì)胞的增殖、凋亡和分化活動，但其在AML細(xì)胞多藥耐藥中的作用和機制尚不明確。
　　目的:
　　在原發(fā)和復(fù)發(fā)AML患者細(xì)胞中篩查SIRT2是否參與AML對藥物的耐受性，并以AML耐藥細(xì)胞株H

3、L60/A及對藥物相對敏感的親代細(xì)胞株HL60為研究對象，研究SIRT2在多藥耐藥中的生物學(xué)作用及其機制。
　　方法:
　　1、對2013年4月～2014年1月中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院收治的25例兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(children acute lymphoblastic leukemia，children-ALL)患者，20例成人急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者

4、，10例原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia，ET)患者，11例慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloidleukemia，CML)患者，8例真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia vera，PV)患者，11例骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasm，MPN)患者及15例AML患者骨髓標(biāo)本進(jìn)行研究，并收集6例正常供者骨髓標(biāo)本為對照。分離單個核細(xì)胞，應(yīng)用實時定量PC

5、R方法檢測骨髓單個核細(xì)胞中SIRT2基因的表達(dá)水平;
　　2、對2013年4月～2014年1月本院收治的15例原發(fā)AML患者及10例復(fù)發(fā)AML患者骨髓標(biāo)本進(jìn)行研究，分離單個核細(xì)胞，應(yīng)用實時定量PCR方法檢測骨髓單個核細(xì)胞中SIRT2基因的表達(dá)水平;
　　3、應(yīng)用實時定量PCR方法及Western Blot的方法檢測AML耐藥細(xì)胞株HL60/A及對藥物相對敏感的親代細(xì)胞株HL60中的SIRT2的表達(dá)水平;
　　4、利用R

6、NA干擾方法，構(gòu)建靶向SIRT2基因的特異性干擾載體，轉(zhuǎn)染SIRT2高表達(dá)的HL60/A細(xì)胞株，并采用RT-PCR、免疫熒光和Western Blot方法檢測下調(diào)后細(xì)胞內(nèi)SIRT2的表達(dá)變化，篩選獲得SIRT2表達(dá)水平下調(diào)的細(xì)胞（HL60-SIRT2-sh）。采用激光共聚焦顯微鏡檢測阿霉素(doxorubicin，DOX)在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，MTT實驗檢測SIRT2沉默前后HL60/A細(xì)胞分別對藥物柔紅霉素(daunorubicin，DNR

7、)和阿糖胞苷(arabinocytidine，Ara-C)敏感性的變化，利用Hoechst染色、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染及Western Blot方法檢測SIRT2沉默對柔紅霉素和阿糖胞苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的影響;
　　5、利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建SIRT2的慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染SIRT2低表達(dá)的HL60細(xì)胞，使其過表達(dá)SIRT2，采用RT-PCR、免疫熒光和Western Blot方法檢測上調(diào)后細(xì)胞內(nèi)SIRT2的表達(dá)變化，

8、篩選獲得SIRT2表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞（HL60-SIRT2）。采用激光共聚焦顯微鏡檢測阿霉素(DOX)在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，MTT實驗檢測過表達(dá)SIRT2前后HL60細(xì)胞對藥物柔紅霉素(DNR)和阿糖胞苷(Ara-C)敏感性的變化，利用Hoechst染色、AnnexinⅤ-FITC/PI雙染及Western Blot方法檢測過表達(dá)SIRT2對柔紅霉素和阿糖胞苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的影響;
　　6、采用Western Blot方法檢測上述干擾、過

9、表達(dá)SIRT2基因的細(xì)胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP1)的變化，對ERK1/2、磷酸化ERK1/2表達(dá)的影響以及相關(guān)蛋白P53和BCL-2的表達(dá)變化，進(jìn)一步采用ERK1/2信號通路抑制劑PD98059研究ERK1/2信號通路在SIRT2參與調(diào)控AML多藥耐藥過程中的作用。
　　結(jié)果:
　　1、在多種白血病患者細(xì)胞中SIRT2的表達(dá)水平均明顯高于正常

10、對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);復(fù)發(fā)AML患者與原發(fā)AML患者比較，細(xì)胞中SIRT2的表達(dá)量增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　2、在AML耐藥細(xì)胞株HL60/A中，SIRT2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于其親代細(xì)胞系HL60(P＜0.05);
　　3、成功構(gòu)建了SIRT2穩(wěn)定干擾的HL60/A細(xì)胞株:HL60-SIRT2-sh1及HL60-SIRT2-sh2;激光共聚焦顯微鏡檢測反射紅色熒光的阿

11、霉素(DOX)在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，結(jié)果顯示SIRT2表達(dá)下調(diào)使得阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的蓄積量增加;MTT實驗結(jié)果顯示沉默SIRT2基因后增加了HL60/A細(xì)胞對柔紅霉素和阿糖胞苷藥物的敏感性;凋亡實驗結(jié)果顯示SIRT2基因沉默的HL60/A細(xì)胞在柔紅霉素、阿糖胞苷藥物分別處理后凋亡細(xì)胞所占比例均比對照組升高，凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9及caspase-PARP的剪切活化形式均較對照組明顯增加，表明SIR

12、T2基因沉默使多藥耐藥細(xì)胞株HL60/A對阿霉素、柔紅霉素及阿糖胞苷的敏感性增強;
　　4、成功構(gòu)建了SIRT2過表達(dá)的HL60細(xì)胞株(HL60-SIRT2);激光共聚焦顯微鏡檢測阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，結(jié)果顯示SIRT2的過表達(dá)使得阿霉素在細(xì)胞內(nèi)的蓄積量減少;MTT實驗結(jié)果顯示過表達(dá)SIRT2后，HL60細(xì)胞對柔紅霉素和阿糖胞苷藥物的敏感性減弱;凋亡實驗結(jié)果顯示過表達(dá)SIRT2的HL60細(xì)胞在柔紅霉素、阿糖胞苷藥物分別處理后凋亡細(xì)

13、胞所占比例均較對照組降低，凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9及caspase-PARP的剪切活化形式均較對照組明顯減少，表明SIRT2的過表達(dá)使HL60細(xì)胞對阿霉素、柔紅霉素和阿糖胞苷的敏感性降低;
　　5、檢測SIRT2基因沉默與過表達(dá)細(xì)胞中MRP1的表達(dá)，結(jié)果顯示在SIRT2基因沉默的HL60/A細(xì)胞中MRP1的表達(dá)量降低，而在SIRT2基因過表達(dá)的HL60細(xì)胞中MRP1的表達(dá)量增高，表明S

14、IRT2能夠調(diào)節(jié)MRP1的表達(dá)水平;在SIRT2基因沉默的細(xì)胞中ERK1/2及其磷酸化水平、P53和BCL-2的表達(dá)水平均有變化，其中ERK1/2及其磷酸化水平和BCL-2表達(dá)量均降低，P53表達(dá)量增高;而在SIRT2基因過表達(dá)的細(xì)胞中這些蛋白的表達(dá)量或磷酸化水平的變化與SIRT2基因沉默細(xì)胞中的變化相反;提示在AML細(xì)胞中SIRT2表達(dá)量的變化能引起ERK1/2相關(guān)信號通路活性的改變;
　　6、進(jìn)一步采用ERK1/2信號通路抑制

15、劑PD98059研究ERK1/2信號通路在SIRT2參與調(diào)控AML多藥耐藥過程中的作用。結(jié)果顯示，在SIRT2基因沉默的HL60/A細(xì)胞或SIRT2基因過表達(dá)的HL60細(xì)胞中，加入ERK1/2信號通路抑制劑PD98059之后，均能夠參與由SIRT2表達(dá)量變化所應(yīng)起的相應(yīng)改變，提示SIRT2通過調(diào)節(jié)ERK1/2信號通路的活性影響AML多藥耐藥。
　　結(jié)論:
　　1、在兒童ALL、成人ALL、ET、CML、PV、MPN及AML等

16、血液病患者骨髓中存在SIRT2高表達(dá)的現(xiàn)象，AML中復(fù)發(fā)患者骨髓細(xì)胞中SIRT2的表達(dá)量高于原發(fā)患者。在AML耐藥細(xì)胞株HL60/A中，SIRT2基因的表達(dá)量明顯高于對藥物敏感的親代細(xì)胞HL60。上述研究結(jié)果首次報道SIRT2在多種血液病中的表達(dá)情況，提示SIRT2可能參與急性髓系白血病多藥耐藥的過程。
　　2、SIRT2的表達(dá)能夠正調(diào)控AML細(xì)胞對阿霉素、柔紅霉素和阿糖胞苷的耐藥水平，在SIRT2高表達(dá)的HL60/A細(xì)胞中下調(diào)S

17、IRT2的表達(dá)能夠減弱HL60/A細(xì)胞對柔紅霉素等藥物的耐藥能力，而在SIRT2相對低表達(dá)的HL60細(xì)胞中過表達(dá)SIRT2則能夠增加HL60細(xì)胞對阿霉素、柔紅霉素和阿糖胞苷的耐藥能力，以上研究結(jié)果證實了SIRT2的表達(dá)水平能夠調(diào)節(jié)AML細(xì)胞對阿霉素、柔紅霉素等藥物的耐藥能力。此外，研究還揭示ERK1/2信號通路介導(dǎo)了SIRT2在AML細(xì)胞多藥耐藥過程中的調(diào)節(jié)作用。研究為探索SIRT2在一些血液病發(fā)生發(fā)展過程中的作用和進(jìn)一步闡明AML細(xì)胞