無義突變RB1和MEN1抑癌基因的翻譯調(diào)控及通讀研究.pdf

1、基因的無義突變在細胞內(nèi)產(chǎn)生了含有提前終止密碼子（premature translation termination codon，PTC）的異常mRNA。這些含有PTC的mRNA在第一輪翻譯過程中被細胞內(nèi)的無義突變介導的mRNA降解途徑(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)所識別和降解，從而消除這種mRNA翻譯產(chǎn)生的截短的、有毒的蛋白質(zhì)對機體的危害。NMD途徑是一種重要的真核生物基因轉(zhuǎn)錄后監(jiān)督機制，是基因表

2、達的翻譯調(diào)控(translation control)。研究發(fā)現(xiàn)，許多癌癥和腫瘤的致病原因是由于無義突變導致抑癌基因表達水平嚴重降低或缺失。因此，抑癌基因無義突變及其翻譯調(diào)控的研究，有助于揭示基因突變引發(fā)癌癥的發(fā)病機制。
　　成視網(wǎng)膜細胞瘤( retinoblastoma, RB)是嬰幼兒眼內(nèi)惡性腫瘤中最常見的一種。1971年，Kundson等人鑒定出了該疾病的致病基因RB1，研究發(fā)現(xiàn)該腫瘤的形成是由于第13號染色體(13q14)

3、上一對等位基因的同時缺失或失活導致的，表明該基因具有抑制腫瘤形成的作用，并首次提出了腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene)的概念。RBGMdb數(shù)據(jù)庫（http://rb1-lsdb.d-lohmann.de/）顯示，所有由RB1基因突變引起的成視網(wǎng)膜細胞瘤病例中，無義突變占到了42.4％。
　　本研究第一部分以RB1基因作為研究對象，探討無義突變RB1基因的表達調(diào)控機制。首先，構(gòu)建了mini-RB1小基因，包括

4、外顯子1~14(cDNA)、內(nèi)含子14?外顯子15?內(nèi)含子15和外顯子16~27(cDNA)三部分序列,將其克隆到真核表達載體pCMV-MH中。根據(jù)人類基因組突變數(shù)據(jù)庫，選擇3個 RB1基因的無義突變位點W99X、G310X和R467X,并構(gòu)建相應(yīng)的無義突變體。分別將mini-RB1基因野生型和無義突變體轉(zhuǎn)入HeLa細胞中進行表達。 qRT-PCR分析結(jié)果顯示,3個無義突變體與野生型相比mRNA水平均無顯著差異，表明無義突變體mini-

5、RB1可能發(fā)生了NMD逃逸現(xiàn)象。為了進一步證實以上結(jié)果，我們利用NMD抑制劑放線菌酮和轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D,分別處理轉(zhuǎn)入野生型mini-RB1基因及其無義突變體W99X和G310X的哺乳動物細胞,發(fā)現(xiàn)處理前后的mini-RB1基因無義突變體的mRNA水平與野生型無明顯差異,進一步說明含有W99X或G310X無義突變的mini-RB1基因的mRNA的確發(fā)生了NMD逃逸。Western blot分析mini-RB1基因的蛋白質(zhì)表達水平,發(fā)現(xiàn)

6、在無義突變位點 W99X和 G310X下游重新起始了蛋白質(zhì)的翻譯。由此，我們認為 PTC下游翻譯的重新起始可能是導致無義mRNA逃逸NMD途徑監(jiān)控的主要原因之一。
　　對于基因無義突變導致的遺傳性疾?。ɡ?，囊性纖維化、血友病等）和腫瘤的治療研究，主要集中于基因通讀藥物，如氨基糖甙類藥物和小分子化合物PTC124，以及臨床藥物，如Amlexanox（用于口腔潰瘍的治療）。藥物處理后在細胞或機體中能夠檢測到全長目的蛋白質(zhì)表達量的提高

7、。通讀藥物在一定程度上可以緩解疾病的臨床癥狀。但由于NMD途徑的監(jiān)控，細胞內(nèi)無義突變基因產(chǎn)生的mRNA被降解，作為通讀藥物的底物，由于含量很低，使全長蛋白質(zhì)的表達量受到限制。
　　本研究的第二部分主要以受NMD途徑調(diào)控的MEN1（多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤I型）基因為研究對象，研究 NMD途徑抑制藥物和通讀藥物的聯(lián)合作用對有效提高全長Menin蛋白表達水平的協(xié)同作用。首先，我們將含有 MEN1小基因及其無義突變體M1（Q141X），M2（Y

8、312X），M3(Y312X)和 M4（Y417X）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 HeLa細胞中，然后用不同濃度的通讀藥物PTC124（0，2，10，20μM）和Amlexanox（0，5，10，100μM）處理細胞，通過Western blot檢測兩種藥物對4個無義突變體全長Menin蛋白表達的恢復效果。確定PTC124和Amlexanox的促通讀作用的最適濃度分別為20μM和100μM。然后，分別用 RNAi和 microRNA方法抑制 NMD途徑，

9、即用pSIR-UPF1和miR125a分別處理轉(zhuǎn)染MEN1小基因及其無義突變體的HeLa細胞。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，抑制NMD途徑的同時用通讀藥物處理可以明顯提高無義突變的MEN1基因在細胞中表達水平，產(chǎn)生的全長Menin蛋白的水平相對于未處理對照最高達10倍。 qRT-PCR分析聯(lián)合處理后細胞中無義突變MEN1基因的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)兩種NMD抑制藥物均增加了mRNA水平，而通讀藥物PTC124一定程度降低了 mRNA水平