nkx2.5新突變的鑒定、功能分析及其無義突變的通讀研究

1、華中科技大學博士學位論文NKX2.5新突變的鑒定、功能分析及其無義突變的通讀研究姓名：歐陽平申請學位級別：博士專業(yè)：遺傳學指導教師：王擎;凃欣2011-04-18II華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文 掃描分析， 目的在于尋找漢族散發(fā)先天性心臟病樣本中 NKX2.5 的突變情況。 我們發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài) rs2277923（Single nucleotide polymorphism，SNP）在病人中具有

2、較高的頻率， 與 105 例對照樣本相比， 小等位基因 A 的頻率顯著 （P=0.04） ， 顯示 NKX2.5 SNP rs2277923 可能與漢族先天性心臟病的發(fā)生相關，還需要加大樣本分析。功能研究表明SNP rs2277923（63a>g）編碼的蛋白定位于細胞核，和野生型相比約降低 20%的轉錄活性。 在第 3 部分的研究中，我們對 8 個已經報道的 NKX2.5 無義突變進行結構和功能分析和氨基糖苷類抗生素誘導無義突

3、變的通讀實驗。首先構建 NKX2.5 無義突變在pcDNA3.1 載體上的表達質粒 （pE109X， pQ149X， pQ170X， pQ187X， pQ198X， pY256X，pY259X 和 pC264X）和 3 個突變（E109X，Q149X 和 C264X）在 pEGFP- N1 上的融合蛋白表達質粒 NKX2.5mut- EGFP。在 HeLa 細胞中對 NKX2.5 的 8 個突變進行免疫熒光定位分析和雙報告熒光素酶系統(tǒng)的

4、轉錄活性檢測。 結果表明 pQ198X， pY256X， pY259X能使 ANFp- Luc 的轉錄活性增加約 2 倍， pC264X 和 pWT- NKX2.5 能使 ANFp- Luc 的轉錄活性增加 4- 5 倍，而 pE109X，pQ149X，pQ170X，pQ187X 完全沒有轉錄活性。pWT- NKX2.5， pQ198X， pY256X， pY259X和pC264X定位于細胞核， 而pE109X， pQ149X，pQ17

5、0X，pQ187X 的定位發(fā)生改變。接下來進行通讀的定性試驗，在 HeLa 細胞中轉染突變的 NKX2.5- EGFP 分別加入氨基糖苷類抗生素慶大霉素（gentamicin）和 G418，孵育 48- 72 h，熒光顯微鏡下觀察 EGFP 的強度，判斷無義突變是否有通讀以及藥物的工作濃度。然后，選擇合適的藥物濃度對 8 個無義突變質粒誘導通讀，并通過檢測誘導后轉錄活性的變化來估算通讀效率。結構- 功能的結果表明 NKX2.5 蛋白的

6、 C 端對于其轉錄活性很重要； HD 區(qū)域內的一段 R/K 富集的序列 （Q187NRRYKCKRQR197） 對于 NKX2.5蛋白的正確定位是必須的。 通讀實驗結果表明 gentamicin 和 G418 均能誘導 8 個 NKX2.5無義突變通讀，并且通讀效率最高可達到 13.8%和 32.2%。該結果為攜帶 NKX2.5 無義突變的先天性心臟病病人的基因治療提供了潛在的可能性。 關鍵詞： 關鍵詞：先天性心臟病 房間隔缺損 NKX