曲霉phyA基因的克隆及在Pichia pastoris中的分泌表達(dá).pdf

1、植酸鹽 (phytate，myo-inositol hexophosphate) 是植物種子中肌醇的主要來源和磷的主要儲存形式，同時也是單胃動物中的一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，是動物糞便中磷污染物的重要來源。植酸酶(EC．3．1．3．8)是組氨酸酸性磷酸酶的一個亞類，催化水解植酸鹽釋放肌醇和無機磷酸。由于植酸酶這種極具應(yīng)用價值的催化特性，人們?yōu)楂@得經(jīng)濟(jì)廉價的植酸酶用于動物飼料添加劑而作出很大的努力。目前已篩選得到許多產(chǎn)植酸酶的物種，包括植物、動物和

2、微生物(特別是真菌和細(xì)菌)。 目前，許多已報道的植酸酶基因主要是通過篩選DNA文庫或cDNA文庫分離得到的。這種方法需要通過PCR擴增獲取目的基因的一段序列或通過測定植酸酶蛋白的部分氨基酸序列來設(shè)計雜交探針，也有通過表達(dá)來篩選基因文庫的報道。然而，這種方法相對而言費時費力。 本文構(gòu)建了一種通過CODEHOP PCR 和 TAIL-PCR聯(lián)用克隆植酸酶基因的方法。選取10個已發(fā)表的來源于不同種屬的真菌組氨酸酸性磷酸酶類植酸

3、酶家族的蛋白(HAPs)序列，Clustal W 比對后選取適合引物設(shè)計的保守區(qū) (blocks)，應(yīng)用CODEHOP程序設(shè)計一對引物CODE1和CODE2。以Aspergillus niger 和Aspergillus oryzae 的總RNA分別反轉(zhuǎn)錄獲得其所表達(dá)基因的第一鏈cDNA。以第一鏈cDNAs為模板，應(yīng)用CODE1和CODE2擴增出植酸酶基因的部分序列。分別針對每個克隆得到的序列設(shè)計兩組嵌套引物，設(shè)計高(G+C)﹪含量的A

4、D引物('arbitrary degenerate primer)，采用TAIL-PCR分別擴增出部分植酸酶基因的5’和3’端未知序列。對克隆得到的序列進(jìn)行組裝，獲得了包含Aspergillus，niger 和Aspergillus oryzae 植酸酶全長基因以及部分5’UTR和3’UTR的序列。 設(shè)計引物擴增出 Aspergillus，niger、Aspergillus oryzae 植酸酶蛋白成熟肽編碼區(qū)(不含信號肽序列)

5、，在引物5’和3’端分別引入．EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ位點。將擴增得到的各真菌植酸酶成熟肽編碼區(qū)連入表達(dá)載體pPIC9，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-x，采用PEG1000介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化 Pichia pastoris GS115，篩選His<'+>Mut<'+>表型的重組酵母GS115-pPIC9-x。 重組酵母用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，對表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行了初步的性質(zhì)分析。結(jié)果顯示，A．niger rPhyA和A．oryzae rPhyA

6、的最適溫度均在55℃左右；在低于55℃時保溫1.5min，A．niger rPhyA和A．oryzae rPhyA的殘余酶活是未保溫處理的樣品活性的50﹪以上，超過55℃保溫處理，酶活則急劇下降；A．niger rPhyA有兩個最適pH，分別為2.5和5.5，其中pH2.5的活性是pn5.5活性的60﹪，A．oryzae rPhyA的最適pH則在6.0，當(dāng)處于pH4.5-6.0的范圍內(nèi)時，這兩種重組酶的活性為最大活性的60﹪以上。SDS