重組Pichia pastoris的發(fā)酵條件研究及SAM的初步分離純化.pdf

1、S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,簡稱SAM或AdoMet)是生物體內(nèi)重要的中間代謝物質(zhì),參與多種生化反應(yīng),具有廣泛和多樣的治療作用.該文綜述了SAM的代謝作用、臨床應(yīng)用和藥理研究進展,并重點介紹其制備方法.針對SAM的不穩(wěn)定性,該文還介紹了SAM的失活機理、穩(wěn)定化理論及其新型穩(wěn)定性鹽.SAM已被用于多種臨床癥狀的治療.SAM作為生化試劑,在國內(nèi)早已有商品供應(yīng),但其價格昂貴無法用于臨床.SAM臨床推廣應(yīng)用

2、的關(guān)鍵在于必須解決大量而價廉的SAM生產(chǎn)工藝.通過微生物的發(fā)酵進而提取SAM是目前SAM的主要工業(yè)生產(chǎn)途徑.SAM的生產(chǎn)一直以S.cerevisiae發(fā)酵為主.該實驗室在對酵母細胞中含硫物質(zhì)代謝研究的基礎(chǔ)上,通過合理改造Pichia pastoris的代謝通路,獲得了一株組成型表達SAM合成酶2(SAMS 2)的重組P.pastoris菌株SIBAS5071.該文對該菌株的發(fā)酵條件進行了系統(tǒng)的研究,考察了碳源、底物、pH、磷酸鹽、溶氧等

3、對該細胞生長和SAM生產(chǎn)的影響,發(fā)現(xiàn)適宜的培養(yǎng)基:20g/L甘油,20g/L蛋白胨,10g/L酵母膏,0.075mol/L L-甲硫氨酸,0.05mol/L磷酸鹽,起始pH6.0,裝液量40ml.發(fā)酵3d后,SAM產(chǎn)量可達2.3g/L(118mg/g干細胞).P.pastoris具有高密度發(fā)酵的優(yōu)點,但在搖瓶發(fā)酵時并沒有很好體現(xiàn)出來,因此這個工程菌的SAM產(chǎn)量還有極大的潛力.該實驗通過發(fā)酵條件優(yōu)化提高重組P.pastoris的SAM生產(chǎn)

4、能力,為簡化SAM的提純步驟提供可能.同時,為發(fā)酵罐發(fā)酵也提供了必要的信息.微生物細胞內(nèi)的SAM主要累積在細胞的液泡中.SAM除具有一個帶正電荷的锍外,還有三個可離子化的基團:pK<,a>分別為1.8、7.8的氨基酸鏈上的羧基和氨基,pK<,a>為3.4的嘌呤環(huán)上的氨基.SAM在酸性條件下帶正電荷,能與陽離子交換樹脂進行離子交換.因此,通過可逆的吸附與解吸,可將其與其它雜質(zhì)分開.該文根據(jù)SAM帶電性,確定了先高氯酸抽提、KHCO<,3>