植酸酶基因在Pichia pastoris中的表達及發(fā)酵條件初步優(yōu)化.pdf

1、植酸酶（EC．3．1．3．8）是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸（或磷酸鹽）的一類酶的總稱，屬于酸性磷酸酶的一個亞類，在飼料行業(yè)極具應用價值。人們?yōu)楂@得經(jīng)濟廉價的植酸酶用于動物飼料添加劑作出了很大的努力。目前已篩選得到許多產(chǎn)植酸酶的物種，包括植物、動物和微生物（特別是真菌和細菌）。 相對于已有的基因克隆策略，本實驗構建了一種通過CODEHOP PCR和TAIL-PCR聯(lián)用克隆植酸酶基因的方法。以Aspergillus niger

2、和Aspergillus orzae的總RNA分別反轉錄獲得其所表達基因的第一鏈cDNA。以第一鏈cDNAs為模板，克隆得到了包含Aspergillus niger和Aspergillus oryzae植酸酶全長基因以及部分5'UTR和3'UTR的序列。并設計引物擴增出Aspergillus niger、Aspergillus oryzae植酸酶蛋白成熟肽編碼區(qū)（不含信號肽序列），在Pichia pastoris GS115中實現(xiàn)甲醇誘

3、導的整合分泌表達。對表達的產(chǎn)物進行的性質分析顯示，A．niger rPhyA和A。oryzae rPhyA這兩個真菌植酸酶基因均屬于組氨酸酸性磷酸酶家族。 在實驗室水平上，畢赤酵母工程菌表達這兩株植酸酶均實現(xiàn)了高效表達，在最適溫度50℃，最適pH值5．5條件下，A．niger rPhyA和A．oryzae rPhyA的植酸酶活性分別達到680U/ml和400U/ml。針對工業(yè)生產(chǎn)中的實際問題，從構建的工程菌株里面選擇酶活高、具有