鹽生杜氏藻（6-4）光裂合酶基因在Pichia pastoris中的表達和功能研究.pdf

1、鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)是一種單細胞真核綠藻,它不僅能在高鹽環(huán)境中生存,而且具有較強的抗紫外特性.該文在已克隆到鹽生杜氏藻(6-4)光裂合酶基因(Ds64PHR)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris,Pp)重組蛋白表達系統(tǒng),將Ds64PHR導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母中進行高效的表達,并對該基因在真核生物中抗紫外功能進行初步驗證.取得的主要研究結(jié)果如下:1.首先采用高壓電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞,通過正

2、交實驗優(yōu)化影響Pichiapastoris轉(zhuǎn)化效率畢赤酵母的轉(zhuǎn)化條件參數(shù),包括電擊電壓,制備感受態(tài)的細胞培養(yǎng)濃度,質(zhì)粒DNA的濃度,擔體DNA的加入,電擊后的復(fù)蘇等.初步得出電擊電壓1500V,培養(yǎng)細胞濃度OD<,600>=1.3時,質(zhì)粒濃度100ng/μ L,總量500ng-1μ g時轉(zhuǎn)化率最高.且在加有擔體DNA時及電擊后進行復(fù)蘇時能較大的提高其電轉(zhuǎn)化效率;2.構(gòu)建了能在Pichia pastoris的高效表達的重組型的表達載體pG

3、APZB-Ds64PHR并進行了分子生物學(xué)驗證;3.將表達載體pGAPZB-Ds64PHR重組到Pichia pastoris基因組DNA中,構(gòu)建GS115-Ds64PHR工程菌并進行了分子生物學(xué)驗證.4.應(yīng)用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析工程菌GS115-Ds64PHR表達外源蛋白Ds64PHR的能力及Ds64PHR表達水平與抗紫外能力的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)它們之間并不是正相關(guān)的關(guān)系.還證明Pichiapastori