日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫的構(gòu)建與東方田鼠抗血吸蟲抗性相關(guān)基因篩選.pdf

1、日本血吸蟲病(Schistosomiasis iaponica)是我國一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病.東方田鼠是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一種具有抗血吸蟲病作用的哺乳動物.如能篩選、克隆出東方田鼠抗血吸蟲抗性相關(guān)的日本血吸蟲基因,可以為開發(fā)抗血吸蟲疫苗和治療藥物提供新技術(shù)、新思路. 噬菌體展示技術(shù)(phage display)是近年建立和發(fā)展起來的利用噬菌體融合表達外源基因的一項新技術(shù),己廣泛應(yīng)用于分子間識別機制的研究.本研究首次應(yīng)用T7噬菌體展示

2、系統(tǒng)構(gòu)建了日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫,并用東方田鼠陰性血清篩選該文庫,以期篩選到與東方田鼠抗血吸蟲抗性相關(guān)的日本血吸蟲基因. 方法與結(jié)果 1.日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫的構(gòu)建:原始文庫的庫容量為4.98×10<'6>pfu,擴增后文庫滴度為3.85×10<'1> pfu/ml.對隨機挑取的96個噬菌斑進行PCR鑒定,重組率為93.8﹪,其中95.6﹪的插入片段大于300 bp.7種特異性引物均能從文庫

3、中釣取到日本血吸蟲成蟲相關(guān)基因. 2.東方田鼠抗血吸蟲抗性相關(guān)基因的篩選:分離東方田鼠陰性血清,用親和淘洗的方法篩選文庫.經(jīng)三輪篩選,陽性克隆得到有效富集,共獲得10種目的基因的EST序列,其中7種與GenBank中登陸的日本血吸蟲基因序列具有高度相似性,相似性達到99﹪～100﹪;1種與其他物種基因有82﹪相似性,另外2種沒有發(fā)現(xiàn)顯著相似的基因.功能預(yù)測結(jié)果表明,部分EST編碼的蛋白或多肽分子功能主要是結(jié)合作用、酶活性及結(jié)構(gòu)蛋

4、白. 結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫,并利用東方田鼠陰性血清成功篩選到10種目的基因的EST序列,為深入闡述東方田鼠抗血吸蟲分子機理和尋找新候選疫苗抗原分子奠定了基礎(chǔ). 目的 構(gòu)建日本血吸蟲成蟲T7噬菌體展示cDNA文庫,為進一步篩選日本血吸蟲保護性抗原基因奠定基礎(chǔ). 方法 用Trizol試劑提取日本血吸蟲成蟲總RNA,分離純化mRNA,經(jīng)隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈

5、cDNA.在雙鏈cDNA末端加上定向EcoR Ⅰ/HindⅢ接頭,再用EcoR Ⅰ和HindⅢ消化,使其成為兩端分別帶有EcoR Ⅰ和HindⅢ粘性末端的雙鏈cDNA.收集300 bp以上的雙鏈cDNA片段,與T7Select 10-3b載體連接,經(jīng)體外包裝后,以大腸埃希菌BLT5403為宿主菌構(gòu)建T7噬菌體展示cDNA文庫.通過滴度測定及PCR技術(shù)鑒定文庫質(zhì)量,用7種特異性引物以PCR法從文庫中釣取目的基因以檢測文庫的代表性.

6、 結(jié)果 原始文庫的庫容量為4.98×10<'6>pfu,擴增后文庫滴度為3.85×10<'11>pfu/ml.對隨機挑取的96個噬菌斑進行PCR鑒定,重組率為93.8﹪,其中95.6﹪的插入片段大于300 bp.7種特異性引物均能從文庫中釣取到日本血吸蟲成蟲相關(guān)基因. 結(jié)論 成功構(gòu)建了日本血吸蟲成蟲T7噬菌體展示cDNA文庫. 日本血吸蟲病(schistosomiasis japonica)是一種危害嚴(yán)重

7、的人畜共患寄生蟲病.自吡喹酮問世以來,對血吸蟲病的防治主要采取以化學(xué)治療為主的綜合防治策略,但化學(xué)療法易使血吸蟲產(chǎn)生抗藥性(Fallon PG等,1994),且不能阻止重復(fù)感染,故發(fā)展合理有效的抗血吸蟲病疫苗是控制血吸蟲病的一個重要策略.迄今已有上百個候選疫苗分子得到了克隆和表達,但它們在單獨使用時所誘導(dǎo)的部分保護力仍不能滿足血防工作的需要,所以繼續(xù)篩選高保護力的候選分子、研制新型疫苗成為當(dāng)前工作的熱點與難點. 噬菌體展示技術(shù)(

8、Phage Display)作為新近發(fā)展起來的生物技術(shù)之一,為我們重新審視傳統(tǒng)的抗血吸蟲疫苗設(shè)計研究策略提供了新的方法.自1985年Smith GP建立噬菌體展示技術(shù)以來,這一技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子間識別機制的研究,特別是抗原表位分析、受體與配體結(jié)合位點確定、蛋白質(zhì)改造以及先導(dǎo)化合物篩選、疫苗研制等方面(Smith GP等,1997).本實驗利用T7噬菌體展示系統(tǒng)構(gòu)建了日本血吸蟲成蟲T7噬菌體展示cDNA文庫,為篩選日本血吸蟲保護性抗原基因

9、及研制新型疫苗提供基礎(chǔ). 第三章東方田鼠抗日本血吸蟲抗性相關(guān)基因篩選 目的 利用東方田鼠陰性血清,篩選日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫,尋找東方田鼠抗血吸蟲抗性相關(guān)基因. 方法 分離東方田鼠陰性血清,用親和淘洗方法篩選文庫.將所得陽性克隆進行測序及生物信息學(xué)分析,確定目的基因. 結(jié)果 經(jīng)三輪篩選,陽性克隆得到有效富集(857倍),共獲得10種目的基因的EST序列,其中7種與G

10、enBank中登陸的日本血吸蟲基因序列具有高度相似性,相似性達到99﹪～100﹪:1種與其他物種基因有82﹪相似性,另外2種沒有發(fā)現(xiàn)顯著相似的基因.功能預(yù)測結(jié)果表明,部分EST編碼的蛋白或多肽分子功能主要是結(jié)合作用、酶活性及結(jié)構(gòu)蛋白. 結(jié)論 發(fā)現(xiàn)了多個與東方田鼠抗血吸蟲抗性相關(guān)基因,為進一步闡述東方田鼠抗血吸蟲病分子機理奠定基礎(chǔ). 日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)是多宿主寄生蟲,除人外,我國

11、已查出了感染和傳播血吸蟲的動物有牛、羊、馬、豬、犬等42種哺乳動物.上世紀(jì)60年代初,我國學(xué)者在血吸蟲疫區(qū)調(diào)查了上萬只東方田鼠(Microtus.fortis),均未發(fā)現(xiàn)血吸蟲成蟲和蟲卵,從此開始了東方田鼠抗血吸蟲現(xiàn)象和機制的研究.近年來的研究表明,東方田鼠血清在其抗血吸蟲病中具有重要性,且有人證明東方田鼠具有抗血吸蟲的天然抗體,'因此,王慶林(2001)、閻玉濤(2001)、張亮(2003)等均利用東方田鼠血清抗體篩選日本血吸蟲cDN

12、A文庫,以期發(fā)現(xiàn)東方田鼠抗血吸蟲病靶抗原基因.但鄔國軍等(2005)對東方田鼠血清組分進行分離后開展體外殺傷血吸蟲實驗,結(jié)果顯示東方田鼠殺傷血吸蟲的物質(zhì)并不僅僅是抗體. 噬菌體展示技術(shù)是近年來建立和發(fā)展起來一種將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因中,使外源基因與外殼蛋白融合表達的新技術(shù),它實現(xiàn)了基因型和表型的結(jié)合,提供了高效率的篩選系統(tǒng).可以通過親和淘洗(biopanning)方法快速、高效地篩選針對任何靶標(biāo)