日本血吸蟲信號蛋白14-3-3的免疫診斷及蟲卵cDNA文庫的構(gòu)建.pdf

1、目的：誘導(dǎo)表達本室保種的含有日本血吸蟲信號蛋白14-3-3(sj14-3-3)編碼基因的重組表達載體pET28a(+)-sj14-3-3，制備并純化出重組蛋白sj14-3-3(rsj 14-3-3)，建立重組抗原間接ELISA方法(rsj-ELISA)診斷日本血吸蟲病，并與日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SjSEA)的間接ELISA、間接血凝試驗(IHA)和環(huán)卵沉淀試驗(COPT)平行檢測，比較幾種方法的敏感性和特異性之間的差異，以探討重組抗

2、原用于診斷血吸蟲病的實用性和可靠性。方法：誘導(dǎo)含sj14-3-3編碼基因的重組質(zhì)粒pET28a(+)-sj14-3-3表達出rsj14-3-3。SDS-PAGE和Western blotting驗證表達量和免疫活性，使用親和層析法純化重組蛋白，并用Bradford法檢測純化蛋白的濃度。將rSj14-3-3和SEA包被反應(yīng)板，棋盤滴定分別確定最適抗原包被量和血清稀釋度，建立rsj-ELIsA和SEA-ELIsA診斷日本血吸蟲病方法。用rs

3、j-ELIsA，SEA-ELISA，SEA-IHA和COPT四種方法平行檢測急性日本血吸蟲病患者64例，慢性日本血吸蟲病患者56例，華支睪吸蟲患者28例，腸道線蟲患者以及正常人血清各32例，比較不同方法之間敏感性，特異性以及交叉反應(yīng)性。結(jié)果：誘導(dǎo)表達重組質(zhì)粒pET28a(+)-sj14-3-3，Ni<'2+>親和層析法純化獲得rsj14-3-3，SDS-PAGE檢測其分子量與理論值一致；Western blotting顯示rSj14-3

4、-3能被其特異性單克隆抗體識別。以rsj14-3-3作為診斷抗原分子，經(jīng)過條件優(yōu)化建立了rSj-ELISA診斷日本血吸蟲病的方法。用rSi-ELISA，SEA-ELISA，SEA-IHA和COPT四種方法平行檢測急、慢性血吸蟲病患者，華支睪吸蟲患者，腸道線蟲患者以及正常人血清，結(jié)果示rsj14-3-3用于日本血吸蟲病免疫診斷與SEA-ELISA以及SEA-IHA具有相似的敏感性和特異性：rsj-ELISA的敏感性顯著優(yōu)于COPT，但特異

5、性(假陽性以及與其他寄生蟲病的交叉反應(yīng)性)遜于COPT。結(jié)論：本研究成功表達并純化了rsj14-3-3抗原，以此抗原單獨包被建立rsj-ELISA方法診斷日本血吸蟲病。重組抗原制備簡便，成本低廉，制備周期短，方法易于標(biāo)準(zhǔn)化，更適合商品化生產(chǎn)和流行區(qū)血吸蟲病的血清學(xué)輔助診斷。 第二部分，目的：構(gòu)建日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫并用日本血吸蟲急性感染患者血清對其進行免疫學(xué)篩選，以尋找有效的早期診斷分子和疫苗候選分子。方法：收集日本血吸蟲

6、感染6周蟲卵，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，PCR合成cDNA雙鏈。經(jīng)過純化、sfi I酶切、過柱除去小片段后，與λTiplEx2噬菌體載體兩臂連接，體外包裝后形成日本血吸蟲蟲卵cDNA文庫。用大腸桿菌預(yù)吸收的急性血吸蟲病患者血清對文庫進行免疫學(xué)篩選，對復(fù)篩得到的14個陽性克隆進行插入片段的核苷酸序列測定，結(jié)果呈送GenBank進行同源性分析，根據(jù)其理論氨基酸組成，初步確定該cDNA插入片段所編碼蛋白的特性并利用生物信息學(xué)軟件分析和

7、預(yù)測其結(jié)構(gòu)和用途。結(jié)果：所構(gòu)建的日本血吸蟲蟲卵cDNA初始文庫的容量為2.7x10<'6>個重組子，經(jīng)感染XL1-Blue菌后擴增文庫的滴度達10<'10>pfu/ml。任意挑取克隆經(jīng)自身環(huán)化后提取質(zhì)粒，酶切后片段大小范圍為400-1500bp,重組率85％以上。用急性日本血吸蟲患者血清初篩得到28個陽性克隆，復(fù)篩得到14個持續(xù)陽性的克隆，測序后送GenBank進行BLAST比對，其中9號為空載序列，2號無同源基因匹配為可能的新基因，其