紅霉素對(duì)煙草煙霧刺激下沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)的影響.pdf

1、本文分析了紅霉素對(duì)煙草煙霧刺激下沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)的影響。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：紅霉素對(duì)煙草煙霧暴露下人巨噬細(xì)胞釋放活性氧及炎癥因子的作用。
　　目的：⑴觀察煙草煙霧刺激對(duì)人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的影響，以及紅霉素能否調(diào)控由煙草煙霧暴露介導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞活性氧（ROS）釋放。⑵觀察煙草煙霧刺激條件下，人巨噬細(xì)胞釋放的白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平改變

2、，以及紅霉素對(duì)于煙草煙霧暴露下人巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子水平的影響。
　　方法：研究對(duì)象為人淋巴瘤單核細(xì)胞株U937，經(jīng)10nM佛波酯（PMA）誘導(dǎo)24h后，U937轉(zhuǎn)換成巨噬細(xì)胞，用香煙煙霧提取物（CSE）刺激人巨噬細(xì)胞。用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)CSE及紅霉素對(duì)細(xì)胞最適宜作用濃度。細(xì)胞分組：對(duì)照組，CSE組（加入1％CSE孵育24h），CSE+紅霉素24h組（1μg/ml紅霉素預(yù)孵育24h后，加入1％CSE繼續(xù)刺激24h），

3、CSE+紅霉素48h組（1μg/ml紅霉素預(yù)孵育48h后，加入1％CSE繼續(xù)刺激24h）。各細(xì)胞組在紅霉素（Erythromycin，EM）、CSE干預(yù)下，以2',7'-二氯二氫熒光素二乙酯（2’,7’-dichlorofluorescin-diacetate，DCFH-DA，10mM）作為熒光探針，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS水平。用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α釋放水平。

4、　　結(jié)果：1%濃度的CSE能顯著上調(diào)人巨噬細(xì)胞ROS的釋放（P<0.01），紅霉素（1ug/ml）預(yù)孵育24h、48h能抑制1%CSE對(duì)細(xì)胞ROS的上調(diào)作用（p<0.01），SIRT1特異性抑制劑（NAM）顯著上調(diào)人巨噬細(xì)胞ROS的釋放（P<0.01）；CSE1%增加人巨噬細(xì)胞釋放IL-6、IL-8、TNF-α，紅霉素（1ug/ml）預(yù)孵育24h減少IL-6、TNF-α釋放（p<0.01）。紅霉素（1ug/ml）預(yù)孵育48h對(duì)人巨噬細(xì)胞

5、釋放IL-6、IL-8、TNF-α的抑制作用更加明顯（p<0.01）。
　　結(jié)論：⑴煙草煙霧刺激引起人巨噬細(xì)胞釋放活性氧增多，紅霉素抑制氧化應(yīng)激機(jī)制之一是通過(guò)抑制活性氧釋放。⑵煙草煙霧刺激促進(jìn)人巨噬細(xì)胞釋放IL-6、IL-8、TNF-α增加，紅霉素抑制炎癥機(jī)制之一通過(guò)抑制人巨噬細(xì)胞釋放IL-6、IL-8、TNF-α。
　　第二部分：紅霉素對(duì)煙草煙霧刺激下人巨噬細(xì)胞內(nèi)SIRT1、NF-κB蛋白表達(dá)及兩種蛋白之間的相互作用。

6、r>　　目的：觀察人巨噬細(xì)胞中SIRT1及NF-κB蛋白表達(dá)在煙草煙霧暴露條件下的改變，以及紅霉素對(duì)煙草煙霧刺激條件下SIRT1和NF-κB蛋白表達(dá)產(chǎn)生何種影響。觀察人巨噬細(xì)胞中SIRT1及NF-κB蛋白是否存在相互作用，以及在煙草煙霧暴露、紅霉素治療下，存在何種相互作用關(guān)系。
　　方法：⑴用10nmol/ml PMA孵育24h可將人淋巴瘤單核細(xì)胞株U937誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞，用CSE刺激巨噬細(xì)胞，制造細(xì)胞在煙草煙霧暴露氧化應(yīng)激模

7、型。分為：對(duì)照組，CSE組，CSE+紅霉素24h組，CSE+紅霉素48h組，NF-κB蛋白特異性抑制劑PDTC組（20nM PDTC預(yù)孵育24h后加入1％CSE繼續(xù)孵育24h），SIRT1特異性抑制劑NAM組（20mM NAM孵育24h）。用westernblot（WB）方法檢測(cè)各組細(xì)胞中NF-κB、SIRT1蛋白表達(dá)。⑵將U937誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞分組并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分為：對(duì)照組，CSE組，CSE+紅霉素24h組，CSE+紅霉素

8、48h組。提取各組細(xì)胞總蛋白，先用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）進(jìn)行蛋白沉淀，再用westernblot（WB）方法檢測(cè)各組細(xì)胞中NF-κB、SIRT1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：1.CSE暴露會(huì)導(dǎo)致人巨噬細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)明顯下降，并能增加NF-κB蛋白表達(dá)，經(jīng)紅霉素預(yù)孵育24h后再予CSE刺激，能促進(jìn)人巨噬細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)升高，同時(shí)抑制NF-κB蛋白表達(dá)升高，經(jīng)紅霉素預(yù)孵育48h

9、后，對(duì)人巨噬細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)升高以及對(duì)NF-κB蛋白的抑制作用更加明顯。
　　結(jié)果：①CSE暴露會(huì)導(dǎo)致人巨噬細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)明顯下降，增加NF-κB蛋白表達(dá)，經(jīng)紅霉素預(yù)孵育24h、48h，均促進(jìn)人巨噬細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)升高，同時(shí)抑制NF-κB蛋白表達(dá)升高，其中48h組更明顯。②經(jīng)Co-IP檢測(cè)，SIRT1和NF-κB蛋白在人巨噬細(xì)胞內(nèi)存在直接相互作用，CSE刺激可導(dǎo)致SIRT1蛋白表達(dá)減少，從而促進(jìn)NF-κB

10、蛋白表達(dá)增加，經(jīng)紅霉素預(yù)孵育24h、48h，可增加人巨噬細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)，抑制NF-κB蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：⑴煙草煙霧導(dǎo)致炎癥的機(jī)制可能是通過(guò)氧化應(yīng)激抑制人巨噬細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)NF-κB蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8、TNF-α釋放。⑵紅霉素抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥機(jī)制可能是通過(guò)紅霉素增加SIRT1蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB蛋白表達(dá)，從而抑制炎癥介質(zhì)釋放。
　　第三部分：紅霉素對(duì)煙草煙

11、霧暴露小鼠肺組織以及肺組織中SIRT1與NF-κB蛋白作用。
　　目的：觀察煙草煙霧暴露對(duì)小鼠肺組織的影響，以及紅霉素對(duì)煙草煙霧暴露小鼠肺組織的作用。觀察受煙草煙霧暴露刺激小鼠的肺組織中SIRT1及NF-κB蛋白表達(dá)的改變，以及紅霉素對(duì)煙草煙霧刺激下對(duì)小鼠肺組織內(nèi)SIRT1及NF-κB蛋白表達(dá)的作用。
　　方法：將8周大小的雄性BALB/c小鼠分為：對(duì)照組，煙草煙霧暴露組，紅霉素治療組。煙草煙霧暴露組每天煙草煙霧暴露2h，持

12、續(xù)12w，紅霉素治療組在煙草煙霧暴露前用紅霉素（100mg/kg·day）灌胃治療，余處理同煙草煙霧暴露組。建模到期后取右肺組織切片行HE染色，剩余肺組織行westernblot檢測(cè)各組小鼠肺組織中NF-κB、SIRT1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴煙草煙霧暴露小鼠肺組織中出現(xiàn)炎癥，支氣管周圍炎癥細(xì)胞聚集，肺組織出現(xiàn)肺氣腫表現(xiàn)。紅霉素治療組炎癥反應(yīng)較煙草煙霧暴露組減輕，肺氣腫表現(xiàn)減輕。⑵煙草煙霧暴露小鼠肺組織中SIRT1蛋白較對(duì)照組明顯