SIRT1調(diào)節(jié)線粒體自噬對豬腸上皮細(xì)胞氧化損傷的影響.pdf

1、腸道是應(yīng)激反應(yīng)的中心器官。當(dāng)機(jī)體受內(nèi)外環(huán)境不利因素刺激時(shí)，極易導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)及功能的損傷，誘發(fā)全身腸源性應(yīng)激綜合征甚至危及生命，因此健康有序的腸道結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定對維持動(dòng)物生長、發(fā)育、繁殖以及免疫功能具有重要意義。線粒體作為細(xì)胞呼吸和能量產(chǎn)生的重要場所，其內(nèi)膜呼吸鏈的氧化磷酸化是活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生的主要來源，線粒體介導(dǎo)的選擇性自噬在降解受損或多余線粒體、維護(hù)線粒體數(shù)量和質(zhì)量的平衡以及細(xì)胞氧化損傷調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)沉默信息

2、調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)與線粒體自噬密切相關(guān)，并參與了細(xì)胞氧化損傷過程，但SIRT1調(diào)節(jié)線粒體自噬在腸道氧化損傷中的作用有待闡明。本研究主要探討SIRT1與豬腸上皮細(xì)胞線粒體自噬的關(guān)系，分析SIRT1對豬腸上皮細(xì)胞氧化損傷的影響，為闡明腸道氧化損傷的分子機(jī)理及抗氧化產(chǎn)品的研發(fā)提供思路與科學(xué)依據(jù)。
　　主要研究內(nèi)容:
　　1.氧化應(yīng)激對豬腸上皮細(xì)胞氧化損傷、線粒體自噬及SIRT1/PGC-1α通路的影響
　　用濃度為30

3、0μM H2O2處理IPEC-1細(xì)胞12h，收取細(xì)胞樣品。分別用DCFH-DA與JC-1探針檢測細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧自由基水平及膜電位變化情況;qPCR和Western Blot分析腸黏膜緊密連接蛋白(ZO-1、Claudin-1和Occludin)、自噬標(biāo)志分子（LC3、Beclin1和p62）、線粒體自噬通路(PINK1/Parkin)、SIRT1及其下游PGC-1α分子的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)氧化應(yīng)激導(dǎo)致豬腸上皮細(xì)胞ROS水

4、平增加、線粒體膜電位水平降低;腸黏膜屏障緊密連接分子mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)受抑制;(2)線粒體自噬標(biāo)志分子LC3、Beclin1、PINK1、Parkin的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，而p62表達(dá)降低;(3)SIRT1及其下游PGC-1α分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。上述結(jié)果表明:氧化應(yīng)激使豬腸上皮細(xì)胞遭受氧化損傷，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，腸上皮細(xì)胞間緊密連接完整性被破壞，激活線粒體自噬水平，同時(shí)抑制SIRT1/PGC-1α信號通路分子

5、的表達(dá)。
　　2.SIRT1對豬腸上皮細(xì)胞線粒體自噬的影響
　　為進(jìn)一步闡明SIRT1在豬腸上皮細(xì)胞線粒體自噬中的作用，首先利用不同濃度的SIRT1特異性小分子激活劑SRT1720（0μM、1.25μM、2.5μM、5μM）和抑制劑EX527(0μM、1μM、5μM、10μM、20μM)分別處理IPEC-1細(xì)胞，24h后提取RNA和蛋白質(zhì)，qPCR和Western Blot分析SIRT1及PGC-1α的表達(dá)水平，篩選激活劑及

6、抑制劑的最佳效應(yīng)濃度;其次用該濃度處理細(xì)胞12h后加入300μMH2O2，12h后收集樣品，qPCR和Western Blot分析自噬標(biāo)志分子LC3、ATG5及線粒體自噬PINK1/Parkin通路的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)SIRT1/PGC-1α通路的表達(dá)水平隨激活劑SRT1720與抑制劑EX527濃度的增加呈現(xiàn)上調(diào)和下降趨勢，并于SRT1720濃度為1.25μM、EX527濃度為1μM時(shí)的激活和抑制效果最為顯著。(2)激活SI

7、RT1可增加線粒體自噬標(biāo)志分子(LC3、ATG5)和PINK1/Parkin通路蛋白的表達(dá)水平，而抑制SIRT1時(shí)則出現(xiàn)相反效應(yīng)。該結(jié)果表明，激活SIRT1后可進(jìn)一步增強(qiáng)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的豬腸上皮細(xì)胞線粒體自噬水平。
　　3.SIRT1對豬腸上皮細(xì)胞氧化損傷的影響
　　由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致豬腸上皮細(xì)胞黏膜屏障受損及線粒體膜電位水平降低，同時(shí)抑制了SIRT1分子的表達(dá)，并且SIRT1能激活線粒體自噬水平，但SIRT1是否參與豬腸上皮細(xì)

8、胞抗氧化損傷作用尚待進(jìn)一步闡明。用SIRT1激活劑和抑制劑分別處理細(xì)胞，12h時(shí)加入300μM H2O2，12h后收集細(xì)胞樣品，分別用DCFH-DA與JC-1探針檢測細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平及膜電位變化情況，qPCR和Western Blot分析腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin基因及Claudin-1蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下激活SIRT1后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量降低，線粒體膜電位水平升高，

9、緊密連接蛋白基因表達(dá)水平均明顯上調(diào)，而抑制SIRT1則出現(xiàn)相反效應(yīng)。該結(jié)果表明:激活SIRT1可顯著逆轉(zhuǎn)豬腸上皮細(xì)胞的氧化損傷狀態(tài)，受抑制時(shí)則進(jìn)一步加重?fù)p傷，SIRT1在豬腸道細(xì)胞應(yīng)激過程中可發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的防御作用。
　　結(jié)論:
　　1.氧化應(yīng)激導(dǎo)致豬腸上皮細(xì)胞氧化損傷:降低線粒體膜電位、破壞細(xì)胞間緊密連接完整性;激活細(xì)胞線粒體自噬水平;抑制SIRT1/PGC-1α信號通路分子的表達(dá)。
　　2.激活SIRT1可進(jìn)一步