焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)短片段牙釉質(zhì)蛋白基因進(jìn)行性別鑒定的研究.pdf

1、目的：性別信息是法醫(yī)檢案過(guò)程中及考古研究過(guò)程中最重要的信息之一。通常在尸表保存完整的情況下，法醫(yī)工作者可以通過(guò)形態(tài)學(xué)分析做出判定。然而面對(duì)重大群體性災(zāi)難事件中人的骨架完整性被破壞，或者由于小孩骨骼發(fā)育不全導(dǎo)致形態(tài)學(xué)分析難以得出鑒定結(jié)論時(shí)，分子水平的鑒定方法就顯得尤為重要了。目前，常用的進(jìn)行性別鑒定的DNA技術(shù)主要包括，Y染色體的特異性探針、鋅指蛋白(ZFY/ZFX)基因和牙釉質(zhì)蛋白基因(Amelogenin gene，AMEL)的檢測(cè)，

2、其中對(duì)牙釉質(zhì)蛋白基因的檢測(cè)應(yīng)用得最為廣泛。自1991年，Nakahori等人對(duì)牙釉質(zhì)蛋白基因進(jìn)行測(cè)序后，Nakahori(1991)、Akane(1991)、Bailey(1992)、Sullivan(1993)先后用PCR擴(kuò)增單拷貝X、Y同源區(qū)域進(jìn)行性別測(cè)定。目前Sullivan法應(yīng)用得最廣泛，在多個(gè)法醫(yī)個(gè)人識(shí)別試劑盒中做為性別鑒定的方法，其擴(kuò)增片段為106bp和112bp。然而，對(duì)于一些高度腐敗降解的生物檢材，以及由于AMEL序列突

3、變及性染色體變異造成的“無(wú)效擴(kuò)增”，現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)往往不能獲得明確的分型結(jié)果。針對(duì)這一問(wèn)題，本研究建立了一種新的性別DNA分析方法，即應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)分析牙釉質(zhì)蛋白基因45bp的DNA片段，并對(duì)該方法的靈敏度，種屬特異性，降解模型，骨骼樣本等法醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行初步研究，以期為一些疑難案件的性別鑒定提供參考。
　　 方法：⑴ 根據(jù)Genebank上提供的AMELX和AMELY的核苷酸序列通過(guò)Blast進(jìn)行比對(duì)后，選擇一段含有3個(gè)單核

4、苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)及1個(gè)插入/缺失位點(diǎn)的序列作為待測(cè)靶序列。用Primer5和Oligo6等引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，一條擴(kuò)增引物標(biāo)記生物素；利用焦磷酸測(cè)序軟件建立預(yù)期模型；對(duì)反應(yīng)體系中的引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果判定性別。應(yīng)用該方法對(duì)100份已

5、知性別(男女各50份)的中國(guó)漢族健康無(wú)關(guān)個(gè)體進(jìn)行測(cè)序分析，驗(yàn)證本方法的可靠性和準(zhǔn)確性。⑵ 選取男女兩份 DNA樣本，定量后稀釋為1ng、0.5ng、0.25ng、0.125ng和0.0625ng進(jìn)行靈敏度檢測(cè)；應(yīng)用本方法對(duì)猴、狗、兔、豬、牛、魚、雞的DNA樣本以及大腸桿菌、腸球菌、念珠菌的菌株進(jìn)行分析，驗(yàn)證其種屬特異性；將新鮮血液放置于6月-11月的自然環(huán)境中26周模擬高度降解檢材，用Dnase I制備人工降解DNA，應(yīng)用本研究構(gòu)建的方

6、法及商品化AmpF/STR IdentifilerTM試劑盒分別對(duì)其進(jìn)行性別分析，比較二者的成功率；提取骨骼樣本DNA，應(yīng)用本方法對(duì)骨骼DNA進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：⑴ 成功構(gòu)建了應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)短片段牙釉質(zhì)蛋白基因進(jìn)行性別鑒定的方法。本方法的擴(kuò)增片段包含上下游引物在內(nèi)只有45bp，同時(shí)包含了多個(gè)點(diǎn)突變和插入缺失突變。焦磷酸測(cè)序圖清晰、直觀、容易判型。應(yīng)用本方法對(duì)100份已知性別個(gè)體DNA的檢測(cè)分析顯示，所有樣本均能得到清

7、晰的分型結(jié)果，與預(yù)期模型無(wú)異，分型結(jié)果準(zhǔn)確。⑵法醫(yī)應(yīng)用評(píng)估：① 本方法能夠正確分型的最低DNA模板量為1ng，具有較高的靈敏度；②在檢測(cè)的所有動(dòng)物及菌株中，應(yīng)用本方法進(jìn)行分析，除在恒河猴檢出產(chǎn)物峰外，其余常見(jiàn)動(dòng)物和微生物均未檢測(cè)到特異性產(chǎn)物峰，具有較好的人類種屬特異性；③ 對(duì)8份降解26周的血液檢材進(jìn)行分析，本方法均得到了清晰正確的分型結(jié)果，而應(yīng)用IdentifilerTM試劑盒檢測(cè)，6份樣本分型明確，2份樣本分型失??；④ 對(duì)Dnase

8、 I 制備的降解DNA進(jìn)行分析，本方法對(duì)Dnase I 消化5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min的DNA均能正確分型，測(cè)序結(jié)果非常清晰，而IdentifilerTM試劑盒僅能對(duì)Dnase I 消化5min、10min的DNA進(jìn)行正確分型，且牙釉質(zhì)蛋白基因產(chǎn)物峰的相對(duì)熒光單位(Rfu)較低，對(duì)消化15min及更長(zhǎng)時(shí)間的DNA均未得到產(chǎn)物峰，分型失??；⑤ 對(duì)6份來(lái)自4種不同部位的骨骼進(jìn)行DNA的提

9、取和分析，除牙齒由于取材量少導(dǎo)致分型失敗外，其余5份骨骼DNA均得到清晰的分型結(jié)果。
　　 結(jié)論：本研究建立了一種應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)牙釉質(zhì)蛋白基因進(jìn)行性別鑒定的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物僅為45bp，操作簡(jiǎn)單、快捷、通量高、成本較低；檢測(cè)的靶位點(diǎn)包括3個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)和1個(gè)插入缺失位點(diǎn)，保證了良好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性；靈敏度達(dá)1ng，具有較好的人類種屬特異性；對(duì)高度降解檢材的檢驗(yàn)成功率明顯高于常規(guī)方法。綜上，本方法對(duì)于高度降解檢材或古DNA的性