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文檔簡介
1、本研究分為二部分:
第一部分:遺傳性釉質(zhì)發(fā)育不全相關(guān)基因Fam83h突變的鑒定與分析
目的:對五個患有遺傳性牙釉質(zhì)發(fā)育不全的家族進行Fam83h 測序分析,以探討其發(fā)病是否與Fam83h突變有關(guān)。
方法:對五個家族所有成員取外周血2ml,用QIAGEN公司的QIAamp DNABlood Maxi Kit 提取基因組DNA。根據(jù)人Fam83h基因組DNA 全長序列設(shè)計7對引物,首先PCR擴增出五
2、個家族先證者的編碼區(qū)Fam83h DNA,然后對所有PCR產(chǎn)物進行測序,對比Genebank的人Fam83h 源序列,尋找Fam83h突變位點。若先證者的某Fam83h位點存在突變,再擴增該家族其他所有招募成員的Fam83h 編碼序列并測序,若所有患者在此位點均有相同變異,而未受影響成員在此位點無變異,則可確認該位點變異為致病突變。
結(jié)果:檢測的五個AI家族中,有兩個家族鑒定出兩個新的致病性的Fam83h突變。家族1 為西
3、班牙人,按照標(biāo)準(zhǔn)命名法,F(xiàn)am83h變異位點為:Fam83hc.1330C>T,p.Q444X,位于外顯子5,突變類型為過早引入終止密碼子,C末端氨基酸缺失735個;家族2為高加索人,F(xiàn)am83h突變位于Fam83hc.1192C>T,p.Q398X,位于外顯子5,突變類型也為過早引入終止密碼子,C末端氨基酸缺失781個。結(jié)合遺傳方式及表型分析,此兩個家族均為常染色體顯性遺傳鈣化不全型AI(ADHCAI)。另外三個招募的AI家族未篩選到
4、Fam83h變異。
結(jié)論:Fam83h cDNA1330位點和1192位點C>T的突變會導(dǎo)致ADHCAI。
第二部分:Fam83h亞細胞定位的研究
實驗一、Fam83h 真核表達載體的構(gòu)建
目的:構(gòu)建融合綠色熒光的Fam83h 真核表達載體。
方法:從日本Yokohama公司購買含有小鼠Fam83h cDNA的質(zhì)粒pBluescriptIIKS+-Fam83h cDN
5、A,設(shè)計Fam83h 引物,引入SalI和BglII酶切位點,PCR 擴增出小鼠Fam83h cDNA 全長編碼區(qū)后,連入PCR2.1-TOPO T 載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10,鋪板,擴增,提取PCR2.1-TOPO-Fam83h 質(zhì)粒,SalI和BglII 雙酶切初步鑒定正確克隆,將酶切正確的克隆測序。SalI和BglII雙酶切測序正確的克隆從而釋放出Fam83h,連入BamHI和SalI 雙酶切過的phrGFP-C綠色熒光表達載體
6、,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10,鋪板,擴增,提取phrGFP-C-Fam83h質(zhì)粒,SalI和NdeI雙酶切初步鑒定正確克隆,將酶切正確的克隆再次測序確認。
結(jié)果:成功擴增出3651bp的小鼠Fam83h編碼區(qū)序列,PCR2.1-TOPO-Fam83h質(zhì)粒測序結(jié)果顯示擴增出的Fam83h序列和genebank收錄的Fam83h源序列完全一致。phrGFP-C-Fam83h 質(zhì)粒測序結(jié)果顯示Fam83h 序列被連入到phrGFP-
7、C正確區(qū)域。
結(jié)論:成功構(gòu)建phrGFP-C-Fam83h熒光真核表達載體,為實驗二和實驗三打下基礎(chǔ)。
實驗二、檢測Fam83h是否為細胞內(nèi)蛋白
目的:體外檢測Fam83h是否為胞內(nèi)蛋白或為分泌性蛋白。
方法:復(fù)蘇HEK293細胞,待細胞生長狀態(tài)良好時,接種入腔室載玻片進行培養(yǎng),接種密度為2-6×105個細胞/cm2。24 小時后,將實驗一構(gòu)建的phrGFP-C-Fam83h質(zhì)粒,
8、與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000按1μg:1μl的比例轉(zhuǎn)染入HEK293細胞,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),6小時后更換培養(yǎng)液。24-72小時后倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及存活率,4%多聚甲醛固定細胞,分別用DiI和DAPI進行胞膜和胞核染色,封片,在熒光顯微鏡下觀察來自Fam83h的綠色熒光是否位于細胞內(nèi)并拍照。
結(jié)果:在HEK293細胞中,來自Fam83h的綠色熒光總是位于染成紅色的胞膜之內(nèi),這充分表明Fam83h是一
9、個胞內(nèi)蛋白,而不是被分泌性到胞外。而且,F(xiàn)am83h的綠色熒光信號很少和胞核重疊,絕大多數(shù)是位于胞核周圍,特別是高爾基體常在的胞核前沿內(nèi)陷處,排除拍照的角度問題,我們推測Fam83h 很可能位于胞核周圍的細胞器,特別是高爾基體。
結(jié)論:Fam83h是一個非分泌性蛋白,它位于細胞內(nèi),但不在胞核內(nèi)。Fam83h 很可能位于胞核周圍的細胞器,特別是與高爾基體密切相關(guān)。
實驗三、檢測Fam83h的亞細胞定位
10、 目的:體外探討Fam83h 亞細胞定位與高爾基體的關(guān)系。
方法:復(fù)蘇HEK293細胞,待細胞生長狀態(tài)良好時,接種入腔室載玻片進行培養(yǎng),接種密度為2-6×105個細胞/cm2。24 小時后,將實驗一構(gòu)建的phrGFP-C-Fam83h質(zhì)粒,與脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 按1 μg:1 μl的比例轉(zhuǎn)染入HEK293細胞,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),6 小時后更換培養(yǎng)液。24-72 小時后倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及
11、存活率,4%多聚甲醛固定細胞,并用DAPI 進行胞核染色及BODIPY 進行高爾基體染色,封片,在熒光顯微鏡下觀察Fam83h 綠色熒光信號與高爾基體的關(guān)系并拍照。
結(jié)果:在HEK293細胞中,來自Fam83h的綠色熒光總是位于高爾基體的紅色熒光之內(nèi),且面積總是小于紅色熒光,這充分表明Fam83h是位于高爾基體之內(nèi)。并且,F(xiàn)am83h 綠色熒光所在位置的高爾基體紅色熒光明顯變淡,甚至無紅色熒光,表明Fam83h 蛋白可能定
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