人DR5胞外區(qū)域多克隆抗體的制備及其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的初步研究.pdf

1、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是多種癌癥治療方法之一。在癌癥治療中腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的死亡受體已經(jīng)成為最具有潛力的治療靶位點(diǎn)之一。DR5(Death receptor 5)是TNFR超家族成員之一,胞內(nèi)結(jié)構(gòu)含有死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain,DD),與其配體TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligandl)特異性結(jié)合后介導(dǎo)TRAIL的凋亡信號,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。抗人DR5單克隆抗體能夠

2、有效殺死腫瘤細(xì)胞,并對正常細(xì)胞無細(xì)胞毒作用,因而成為抗腫瘤抗體藥物研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。但是單抗制備繁瑣且成本高,在臨床上尚難廣泛應(yīng)用。而多克隆抗體制備簡單且價(jià)格便宜。目前尚未見抗人DR5多克隆抗體對腫瘤殺傷作用的報(bào)道。因此我們制備了抗人DR5多克隆抗體,初步研究了人DR5多抗誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系凋亡的效果。 本文采用RT-PCR方法從人肝癌細(xì)胞HepG2中成功克隆出人DR5胞外區(qū)域(eDR5),構(gòu)建重組克隆載體。pMD-eDR5測序鑒定

3、正確后構(gòu)建三種原核重組表達(dá)載體pET-Trx-eDR5(P1P2),pGEX-eDR5(P1P2)和pET-26b(+)-eDR5(P3P4)并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中獲得不同程度表達(dá)。我們選用了具有較高表達(dá)量且廣泛用于表達(dá)重組蛋白的pGEX-eDR5(P1P2)重組表達(dá)載體,做進(jìn)一步的研究。經(jīng)Western blot鑒定,pGEX-eDR5證實(shí)所表達(dá)的融合蛋白是GST-eDR5。然后采用親和層析法分離純化融合蛋白GST-eDR5,再

4、通過切膠、透析獲得高純度的融合蛋白GST-eDR5。用高純度的免疫原(GST-eDR5),免疫小鼠制備了抗人DR5多克隆抗體,并用GST蛋白純化抗血清。純化后的抗血清不再識別GST蛋白,但仍能識別HepG2細(xì)胞中的DtL5蛋白和GST-eDR5融合蛋白。此血清純化方案尚未見報(bào)道。通過Western blot、ELISA方法鑒定抗血清特異性和效價(jià),獲得高特異性,效價(jià)高達(dá)1:25600的抗DR5多克隆抗體。用制備好的抗人DR5多克隆抗體處理