抗DR5抗體誘導(dǎo)鼠肝癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，居我國癌癥發(fā)病率的第二位，每年約有13萬人死于肝癌。近些年來其發(fā)病率和死亡率有逐年升高的趨勢。由于其具有侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性，目前包括手術(shù)、放療、化療等各種治療方法的效果均不佳，而生物治療在肝癌綜合治療中的應(yīng)用取得較大進(jìn)展，成為腫瘤治療的第四模式。死亡受體5(DR5/TRAILR2)是TRAILR中的一員，屬于腫瘤壞死因子受體超家族。當(dāng)它與相關(guān)配體結(jié)合時，能選擇性地殺傷多種腫瘤細(xì)胞而對正常

2、細(xì)胞沒有毒性，曾被譽(yù)為最有發(fā)展前途的抗腫瘤靶點(diǎn)。本文將抗Anti—DR5mAb體內(nèi)、外作用于鼠肝癌細(xì)胞，并聯(lián)合應(yīng)用化療藥物阿霉素(ADM)或放線菌素—D(ACTD)，觀察Anti—DR5mAb與化療藥物對肝癌細(xì)胞的協(xié)同殺傷作用，以研究探討Anti—DR5mAb與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于肝癌的治療作用及機(jī)制。 我們采用重疊PCR．技術(shù)獲得了DR5基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET22b(+)/DR5，通過優(yōu)化其表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)目的蛋白在大腸桿菌

3、Rosetta—gami中的高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物主要以包函體的形式存在，且表達(dá)量占菌體總蛋白的30％以上。用鎳親和層析柱純化目的蛋白，得到的蛋白純度均在95％以上。ELISA結(jié)果表明所純化的蛋白可與抗DR5抗體發(fā)生特異結(jié)合。用純化的sDR5免疫小鼠，制備Anti—DR5mAb，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)與細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測Anti—DR5mAb、ADM和ACTD誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。建立小鼠肝癌模型，皮下注射Anti—DR5mAb、ADM、ACTD、

4、Anti—DR5mAb—ADM和Anti—DR5mAb—ACTD，觀察它們對小鼠腫瘤體積與重量增長的抑制、小鼠體重的增加以及對小鼠存活率的影響作用，并通過HE染色和TUNEL實(shí)驗(yàn)觀察其對肝癌細(xì)胞的凋亡作用以及對正常肝細(xì)胞是否具有毒性作用。 結(jié)果表明，Anti—DR5mAb、ADM和ACTD作用于肝癌細(xì)胞后，均可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，Anti—DR5mAb、ADM、ACTD、Anti—DR5mAb—ADM和Anti—DR5mAb—AC

5、TD作用于HCC小鼠后，使小鼠腫瘤重量增加減緩，極大的延長了小鼠的存活時間，HE染色與TUNEL實(shí)驗(yàn)也顯示Anti—DR5mAb與ADM/ACTD化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時，對誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡具有協(xié)同增效作用，同時，大幅度降低了Anti-DR5mAb、ADM和ACTD化療藥物對正常肝細(xì)胞的毒性。 總之，我們通過基因工程技術(shù)成功地構(gòu)建了DR5基因，并在原核表達(dá)體系獲得高效表達(dá)。純化復(fù)性DR5蛋白免疫小鼠，制備了Anti-DR5mAb。An

6、ti-DR5mAb用于小鼠肝癌的治療，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Anti-DR5mAb、ADM、ACTD對HCC細(xì)胞具有協(xié)同殺傷作用，聯(lián)合應(yīng)用時對正常肝細(xì)胞的毒性小。這種協(xié)同殺傷效應(yīng)是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的，其機(jī)制可能是由于凋亡鏈中的正反饋而使凋亡級聯(lián)放大，亦可能是亞毒性劑量的ADM、ACTD可高效阻斷凋亡抑制蛋白或誘騙受體的生成，而使TRAIL誘導(dǎo)的凋亡呈現(xiàn)高效。Anti-DR5mAb作用肝癌的機(jī)制不僅是通過細(xì)胞凋亡的途徑，還可能與線粒體依