抗DR5抗體誘導鼠肝癌細胞凋亡的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，居我國癌癥發(fā)病率的第二位，每年約有13萬人死于肝癌。近些年來其發(fā)病率和死亡率有逐年升高的趨勢。由于其具有侵襲性強、易復發(fā)、轉移等生物學特性，目前包括手術、放療、化療等各種治療方法的效果均不佳，而生物治療在肝癌綜合治療中的應用取得較大進展，成為腫瘤治療的第四模式。死亡受體5(DR5/TRAILR2)是TRAILR中的一員，屬于腫瘤壞死因子受體超家族。當它與相關配體結合時，能選擇性地殺傷多種腫瘤細胞而對正常

2、細胞沒有毒性，曾被譽為最有發(fā)展前途的抗腫瘤靶點。本文將抗Anti—DR5mAb體內、外作用于鼠肝癌細胞，并聯(lián)合應用化療藥物阿霉素(ADM)或放線菌素—D(ACTD)，觀察Anti—DR5mAb與化療藥物對肝癌細胞的協(xié)同殺傷作用，以研究探討Anti—DR5mAb與化療藥物聯(lián)合應用于肝癌的治療作用及機制。 我們采用重疊PCR．技術獲得了DR5基因，構建原核表達載體pET22b(+)/DR5，通過優(yōu)化其表達條件，實現目的蛋白在大腸桿菌

3、Rosetta—gami中的高效表達。表達產物主要以包函體的形式存在，且表達量占菌體總蛋白的30％以上。用鎳親和層析柱純化目的蛋白，得到的蛋白純度均在95％以上。ELISA結果表明所純化的蛋白可與抗DR5抗體發(fā)生特異結合。用純化的sDR5免疫小鼠，制備Anti—DR5mAb，應用流式細胞術與細胞毒性試驗檢測Anti—DR5mAb、ADM和ACTD誘導肝癌細胞凋亡的作用。建立小鼠肝癌模型，皮下注射Anti—DR5mAb、ADM、ACTD、

4、Anti—DR5mAb—ADM和Anti—DR5mAb—ACTD，觀察它們對小鼠腫瘤體積與重量增長的抑制、小鼠體重的增加以及對小鼠存活率的影響作用，并通過HE染色和TUNEL實驗觀察其對肝癌細胞的凋亡作用以及對正常肝細胞是否具有毒性作用。 結果表明，Anti—DR5mAb、ADM和ACTD作用于肝癌細胞后，均可誘導肝癌細胞凋亡，Anti—DR5mAb、ADM、ACTD、Anti—DR5mAb—ADM和Anti—DR5mAb—AC

5、TD作用于HCC小鼠后，使小鼠腫瘤重量增加減緩，極大的延長了小鼠的存活時間，HE染色與TUNEL實驗也顯示Anti—DR5mAb與ADM/ACTD化療藥物聯(lián)合應用時，對誘導肝癌細胞凋亡具有協(xié)同增效作用，同時，大幅度降低了Anti-DR5mAb、ADM和ACTD化療藥物對正常肝細胞的毒性。 總之，我們通過基因工程技術成功地構建了DR5基因，并在原核表達體系獲得高效表達。純化復性DR5蛋白免疫小鼠，制備了Anti-DR5mAb。An

6、ti-DR5mAb用于小鼠肝癌的治療，體內外實驗結果顯示Anti-DR5mAb、ADM、ACTD對HCC細胞具有協(xié)同殺傷作用，聯(lián)合應用時對正常肝細胞的毒性小。這種協(xié)同殺傷效應是通過誘導細胞凋亡而實現的，其機制可能是由于凋亡鏈中的正反饋而使凋亡級聯(lián)放大，亦可能是亞毒性劑量的ADM、ACTD可高效阻斷凋亡抑制蛋白或誘騙受體的生成，而使TRAIL誘導的凋亡呈現高效。Anti-DR5mAb作用肝癌的機制不僅是通過細胞凋亡的途徑，還可能與線粒體依