抗DR5單克隆抗體的研制及其定量雙抗體夾心ELISA方法的建立.pdf

1、第一部分：分泌抗死亡受體-5單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立及鑒定 目的：分泌抗死亡受體-5單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立、及其單克隆抗體的制備、純化與鑒定。 方法：①以純化的DR5分次免疫BALB/C小鼠，分離小鼠脾細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合；②采用ELISA法初篩抗DR5陽性孔，并對陽性孔進(jìn)行克隆。以Jurkat細(xì)胞做為靶細(xì)胞，采用FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測陽性克隆孔雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；③采用有限稀釋法克隆

2、雜交瘤細(xì)胞3次，獲取單細(xì)胞雜交瘤；MTT方法特異性篩選有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的雜交瘤細(xì)胞，通過FITC-AnnexinV/PI雙色標(biāo)法FCM檢測Jurkat細(xì)胞凋亡率；④采用小鼠單克隆抗體型別鑒定試劑盒ELISA測定mAb的類型及亞型；⑤熒光標(biāo)記二抗，F(xiàn)CM測定單抗結(jié)合DR5特異性；⑥ELISA檢測mAb的抗原表位及親和常數(shù)；⑦將抗DR5單克隆抗體細(xì)胞株注射至小鼠腹腔，獲得大量富含單抗的腹水，通過親和層析技術(shù)可得到大量純化的抗DR5的單抗。

3、 結(jié)果：①通過細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)獲得3株可穩(wěn)定分泌抗DR5mAb的雜交瘤細(xì)胞株：命名為YM366EC、YM366ED、mDRA-6。其中1株mAbmDRA-6具有TRAIL活性，可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡；②sDR5對mAb同DR5結(jié)合的阻斷實驗結(jié)果表明mAbYM366ED和mAbYM366ED與DR5可特異性結(jié)合；③3株雜交瘤細(xì)胞所有產(chǎn)生的抗DR5mAb均能與sDR5結(jié)合；④阻斷實驗結(jié)果表明sDR5能夠完全阻斷抗DR5mAb與

4、Jurkat細(xì)胞膜的結(jié)合，表明抗DR5-mAb與細(xì)胞膜DR5的結(jié)合是特異性的；⑤FITC-AnnexinV/PI雙染法流式細(xì)胞儀測檢及電泳結(jié)果表明，在0.5μg/ml濃度作用4h，mDRA-6誘導(dǎo)87.84％細(xì)胞凋亡；⑥經(jīng)鑒定三株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體亞型為IgG1；抗原表位類型為構(gòu)象表位；mAbYM366EC、YM366ED和mDRA-6可識別DR5不同的抗原表位；其特異性識別人DR5，與人Fas、DR4等無免疫交叉反應(yīng)；⑦用降至烷與福

5、氏不完全佐劑預(yù)處理小鼠比液體石蠟效果好，前者腹水產(chǎn)生快而且量也多；雌鼠與雄鼠之間腹水的產(chǎn)量無明顯差異；⑧以非競爭酶免疫法測定的mAb的親和常數(shù)，結(jié)果表明mAbYM366EC和YM366ED與DR5結(jié)合的親和常數(shù)，分別為2.63×109L/mol和1.00×109L/mol；⑨經(jīng)硫酸銨沉淀和蛋白G親合層析制備抗體，SDS-PAGE顯示輕鏈和重鏈兩條帶，表觀分子量分別為27kD和48kD，相對分子量為150kD，純度為100％。 結(jié)

6、論：獲得3株可分泌抗DR5mAb的雜交瘤細(xì)胞株，其中一株可分泌具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性抗體的雜交瘤細(xì)胞；另外兩株雜交瘤細(xì)胞系YM366EC、YM366ED分泌的抗體無誘導(dǎo)凋亡活性，可識別2種不同的抗原表位。為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性與檢測方法的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。 第二部分：定量測定DR5雙抗體夾心ELISA方法的建立 目的：建立敏感性、特異性和重復(fù)性好的定量檢測DR5的雙抗體夾心ELISA方法，并探討紫外線照射微孔板、洗滌

7、液和抗體稀釋液、封閉液的種類等對實驗結(jié)果的影響，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：①采用proteinG層析法純化獲得兩株識別不同表位的抗DR5單克隆抗體；②其中一株IgG標(biāo)記HRP；③另一株包被反應(yīng)板，加待測定血清和DR5陽性及陰性對照，加標(biāo)記的IgG抗體，經(jīng)顯色后測定A值。從標(biāo)準(zhǔn)DR5曲線上定量樣品中DR5量。其特異性達(dá)98％以上，靈敏度達(dá)0.01ug/L；④利用研制的診斷試劑盒用于臨床病人體液中DR5的含量測定。初步檢測了50份

8、臨床標(biāo)本。 結(jié)果：①反應(yīng)板經(jīng)紫外線照射后，檢測DR5的OD值均高于未照射組，提示紫外照射處理微孔板可提高檢測的靈敏度；②不同洗滌液和酶標(biāo)抗體稀釋液對實驗結(jié)果影響結(jié)果表明Tris液比PBS檢測DR5的OD值高0.1～0.3，而且本底比PBS低0.05；③封閉液的實驗結(jié)果顯示10％的胎牛血清封閉效果最好；④所建立的標(biāo)準(zhǔn)雙抗體夾心ELISA法檢測DR5的變異系數(shù)均小于5％，說明實驗的重復(fù)性好，回收率均在85％以上，實驗的準(zhǔn)確性較高；⑤