DR5在內毒素誘導肝細胞凋亡中的作用.pdf

1、內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的成份，其主要組成部分是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。有研究顯示LPS能夠激活包括外周血單核細胞在內的各種細胞，能夠誘導細胞分化成熟或產(chǎn)生各種內源性的活性物質，如TNFs，IFNs，ILs和CSFs等?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多細菌感染能觸發(fā)或抑制細胞凋亡，并且有結果顯示細菌引起的細胞凋亡中有腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體TRAIL(TNF-relateapoptosis-inducing lig

2、and TRAIL)的參與。TRAIL又稱為凋亡素2配體(APO-2L)。它屬于TNF超基因家族成員，正如該家族的其他成員一樣，TRAIL以Ⅱ型跨膜蛋白為主要表達方式。TRAIL能夠誘導多種腫瘤細胞凋亡而對大多數(shù)正常細胞無影響。它通過與腫瘤細胞膜上的相應受體結合誘導細胞凋亡，目前已發(fā)現(xiàn)TRAIL有5個受體，其中TRAIL受體1(死亡受體4 death receptor 4，DR4)和TRAlL受體2(死亡受體5death recepto

3、r 5，DR5)胞內段含有死亡結構域，能夠傳遞凋亡信號，TRAIL通過與細胞膜上的DR4或DR5相互作用從而誘導細胞凋亡。在生理條件下DR5與TRAIL的親和力明顯大于DR4，因此，在TRAIL誘導細胞凋亡過程中起主要作用的受體是DR5。研究發(fā)現(xiàn)細菌內毒素可以誘導多種細胞凋亡，但內毒素引起細胞凋亡的機制還不完全清楚。內毒素引起細胞凋亡與TRAIL的相關性如何鮮見報道。為探索TRAIL在內毒素誘導細胞凋亡中的潛在作用，我們進行本項目的研究

4、。 目的：主要探討TRAIL的受體DR-5在內毒素引起肝細胞凋亡中的作用及可能機制，并為進一步研究內毒素與其它細胞因子在肝細胞凋亡中的作用提供指導，同時也為臨床上肝病治療研究提供新的思路。 方法：實驗分體外細胞學實驗和動物實驗兩部分。 第一部分：體外細胞學實驗，將人肝HL7702細胞常規(guī)培養(yǎng)貼壁后，分為對照組、內毒素處理組、抗人DR5單抗mDRA-6處理組及聯(lián)合組(內毒素+mDRA-6)。在做不同處理后倒置顯微鏡

5、下觀察L02細胞形態(tài)變化；MTT法檢測內毒素對L02細胞生長的影響；流式細胞術檢測L02細胞表面DR5的表達率；Annexin-V和PI雙染法檢測細胞凋亡率。 第二部分：動物實驗，選用6-8周齡的健康BALB/c小鼠，實驗分為三組：陰性對照組、單獨內毒素處理組和DR5封閉TRAIL組。在做不同處理后檢測小鼠血清中ALT、AST和LDH含量變化；HE染色鏡下觀察肝細胞凋亡；Annexin-V和PI雙染法檢測肝細胞凋亡率；流式細胞術

6、檢測肝細胞表面DR5的表達率；免疫組化檢測肝細胞DR5的表達。 結果： 1.經(jīng)LPS處理的L02細胞呈現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)特征，出現(xiàn)核固縮、染色質邊緣化、凋亡小體形成。流式細胞術分析表明：對照組L02細胞表面DR5的表達率為4.8％，用LPS(10 mg/L)處理12 h后，DR5表達率上調為37.76％。L02細胞12h凋亡率：LPS處理組、抗人DR5單抗mDRA-6處理組、LPS聯(lián)合mDRA-6組細胞凋亡率分別為37.7

7、8％(早期凋亡21.65％，晚期凋亡16.13％)、29.58％(早期凋亡18.21％，晚期凋亡11.37％)和65.81％(早期凋亡50.61％，晚期凋亡15.20％)(p<0.05)。 2.經(jīng)LPS處理后小鼠血清中ALT、AST和LDH的含量隨著時間延長呈進行性升高，在處理24h三種酶的含量達到最高峰，隨后開始下降。HE染色鏡下觀察單獨內毒素處理組肝細胞凋亡較多，可見細胞體積縮小，胞質致密深染，形成致密質塊，并出現(xiàn)凋亡小體。

8、DR5封閉TRAIL組細胞凋亡減少。流式檢測小鼠肝細胞凋亡率：單獨內毒素處理組細胞凋亡率為45.02％(早期凋亡為13.59％，晚期凋亡為31.43％)。DR5封閉TRAIL組小鼠肝細胞凋亡率27.62％(早期凋亡為11.47％，晚期凋亡為16.15％)；免疫組化染色觀察細胞DR5的表達：單獨內毒素處理組小鼠肝細胞DR5的表達率比對照組明顯增高。流式檢測對照組小鼠肝細胞表面DR5的表達率是4.21％；單獨內毒素處理組小鼠肝細胞DR5的表

9、達率明顯增高為46.71％。 結論：1.內毒素可以通過上調細胞表面DR5的表達誘導人肝細胞凋亡，細胞凋亡率與內毒素的劑量及細胞表面DR5表達率呈相關性，內毒素引起的人肝細胞凋亡是TRAIL的受體DR5起主要作用。 2.內毒素可以誘導小鼠肝細胞凋亡，并且在內毒素誘導下細胞表面DR5的表達率明顯增高。sDR5可以和小鼠體內的TRAIL相結合使肝細胞凋亡減少，內毒素可以通過上調小鼠肝細胞表面DR5的表達來誘導細胞凋亡，內毒素誘